齊墩果酸新對肝癌的抑制作用研究進展

蘇 雨，王海珠,楊 彬,萬明霞,劉馨澤,張璟祎,王浩天

(吉林大學藥學院，吉林 長春130021)

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國大約3億人患有肝臟疾病，每年約有38.3萬人死于肝癌,占全球肝癌死亡病例數的51%,嚴峻的形勢給我國的社會和醫療帶來了沉重的負擔。齊墩果酸(oleanolicacid，OA)是以游離形式廣泛存在于草本植物中，如女貞子，西洋參，連翹，三七，人參等的五環三萜類化合物。該藥在20世紀70年代就開始用于治療肝炎。近年來，更有研究表明，OA能夠抑制惡性腫瘤如肝癌[1]、肺癌[2]等的生長有良好的作用，但其分子生物學作用機制尚不明確，現從細胞分子的層面上將肝癌的發病機制及特性，齊墩果酸的特性及其抑制肝癌機制綜述如下。

1 肝癌的發病機制

迄今為止，肝癌的致病原因尚待研究。目前認為肝癌的發生是由病毒性特異因子、免疫機制、環境因素和個體遺傳背景相關基因共同作用的結果。

在我國，HBV、HCV或二者雙重感染會顯著增加患肝癌的幾率。其中乙型病毒蛋白HBx可能通過調節氧化應激、DNA修復、信號轉導、轉錄、蛋白質降解、細胞周期進程和細胞凋亡相關信號通路的調節，從而在病毒誘導的肝細胞癌中起重要作用[3]。另有基因測序技術表明肝癌細胞中，HBV DNA整合位點與易感基因/單核苷酸多態性也對肝癌由重要作用[4]。在西方，HCV誘導慢性炎癥進而促進肝癌發展，這一過程中包含了持續性慢性肝炎及纖維化、不可逆的遺傳改變以及惡性克隆[5]。

近年來有研究發現，肥胖、糖尿病及其代謝綜合征會引起非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，NAFLD可能在炎癥因子、氧化應激、信號通路的激活及抑癌因素的減少的情況下發展成肝癌，但具體機制尚未明確，可能通過誘導肝臟的胰島素抵抗及多種促炎性細胞因子(如TNF-α、IL-6)、血管活性因子及促氧化分子的釋放來導致肝癌的發生和發展，也需進一步的研究加以證實[6]。肝癌的發展與Hh的同源基因Shh信號通路激活后，增加細胞因子B1與周期依賴性蛋白激酶CDK1蛋白表達，進而明顯促進肝癌細胞的增殖[7]。異常激活細胞外信號調節蛋白激酶ERK使其磷酸化，激活靶分子c-Fos等[8]或異常激活c-Jun N末端蛋白激酶JNK信號通路引起下游通路蛋白P53等表達，從而促進肝癌增殖及血管生成，參加調控肝癌細胞的周期與凋亡進程[9]。還有Notch信號通路作為多信號通路的交點，與TGF-β和NF-κB間接作用，在腫瘤細胞的增殖、成長、凋亡、遷徙、侵襲及血管生成中也其重要作用[10]。

2 肝癌的異質性和特性

腫瘤異質性是惡性腫瘤廣泛存在的特性之一，其中肝癌異質性最為明顯。諸多研究表明腫瘤異質性這一重要特征在肝癌的發生、發展中起重要作用[11]。

現在普遍認為腫瘤異質性的發生機理主要有克隆進化模型和腫瘤干細胞模型兩種。第一種為在正常細胞向腫瘤細胞轉變這一階段，基因多次突變，造成基因型多樣性與表型上的改變，從而導致腫瘤異質性。第二種則認為腫瘤干細胞分化產生不同克隆的腫瘤細胞亞群，二者相互形成動態作用造成腫瘤異質性。

目前多認為肝細胞癌多中心發生或原發癌的轉移可以顯示出顯著的肝癌異質性。通過累積不同基因的改變而形成肝癌的多發生中心，Miao等多研究發現在轉移灶內發現大量的相似的突變型基因[12]，有相似的基因譜，展現了肝癌的異質性[13]。上面我們提到腫瘤干細胞，研究發現具備干細胞表型的肝癌亞型預后差,難以用統一的標準進行界定。Tang[14]、Yamashita[15]等實驗發現不同類型表達的肝癌細胞具有不同的生物學行為，例如能促進血管生成和腫瘤起始能力；或具有細胞內皮特性易于細胞轉移；或賦予細胞耐藥特性，這些也影響了肝癌的異質性。

3 齊墩果酸的生物學特性

齊墩果酸是一種天然五環三萜酸類化合物，廣泛存在與蔬菜、水果、草藥當中，是最為常用的天然生物活性成分。在幾十年前被我國批準用來作為保肝藥以及腫瘤病人的免疫調節劑。大量研究表明齊墩果酸有廣泛的生物活性及藥理作用，包括抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病、保肝、抗骨質疏松等，其中最為有發展空間的實數它的抗腫瘤功效[16]。

齊墩果酸作為重要的植物提取物，已有實驗探討了以肝癌[17]、白血病[18]、肺癌[19]為研究對象的試驗中驗證了其具有克制腫瘤生長的效應。通過抑制腫瘤生長三個階段的相關通路及基因，主要體現在抑制腫瘤細胞增殖[20]、誘導腫瘤細胞凋亡[21]、抑制腫瘤新生血管形成[22]、抑制腫瘤細胞侵襲[23]以及逆轉腫瘤細胞及促進腫瘤細胞分化[24]的作用。

4 齊墩果酸對肝癌的抑制作用

4.1 抗侵襲和抗轉移作用

腫瘤侵襲是腫瘤細胞脫離原發部位，穿透基底膜，向周圍組織浸入生長的過程。腫瘤轉移是腫瘤細胞通過毛細血管和淋巴管移動，離開腫瘤原發灶或繼發灶，形成新的腫瘤的過程，腫瘤的轉移也可以看成腫瘤侵襲的進一步發展。腫瘤的侵襲和轉移是一個復雜、受多個影響因素控制的過程，任何參與調控的基因和涉及到的步驟發生改變，都有可能對侵襲和轉移產生影響。

在Chun-Che Lin 的報道[25]中指出OA 可以影響肝癌細胞株Hep3B、Huh7 和 HA22T的浸潤和遷移。還有研究表明，齊墩果酸對PGCL3細胞穿膜侵襲能力有顯著抑制作用，PGCL3細胞的穿膜運動能力和粘附能力，也均有顯著下降，其中OA是通過對黏附、運動、降解等多個侵襲作用的機理產生抑制，而不是在某一單一路徑產生抑制[26]。另一實驗進一步證實了QA對PCCL3細胞侵襲和轉移的抑制作用，并認為其抗轉移和侵襲機制是促進腫瘤細胞表型分化，從而使參與侵襲轉移的蛋白酶產生減少，控制腫瘤細胞的侵襲和轉移，同時抑制了新生血管的產生[27]。腫瘤能夠誘導新生血管的形成而具有豐富的血管，其生長、侵襲和轉移都依賴血管作為體內的主要渠道來供給氧氣和營養物質，因而腫瘤的侵襲和遷移依賴腫瘤血管的生成，因此，抑制腫瘤的侵襲和遷移的核心為抑制腫瘤血管的生成。

4.2 抑制新生血管

目前研究表明腫瘤的生長、侵襲和轉移過程都依賴血管作為體內的主要渠道來供給氧氣和營養物質，而血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是調節血管形成的主要細胞因子。VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白，部分能作用于血管內皮細胞促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性。在正常生理條件下，VEGF作用于其特異性受體后，引起多個信號反應，促進血管增生。在低氧環境下，腫瘤分泌大量的VEGF，VEGF通過提高血漿酶原活化因子(PA)和血漿酶原活化因子抑制因子-l(PAI-1)的mRNA表達，來提高血漿酶原活化因子的活性，促進細胞外蛋白水解，進而促進新生毛細血管的形成。腫瘤內高濃度的VEGF能夠使血管的通透性增加，增加腫瘤細胞的侵襲能力[28]。有研究表明OA通過抑制VEGF在肝癌中的表達，降低VEGF的水平，從而發揮抑制腫瘤生長的作用。

4.3 調節信號通路，對細胞凋亡的影響

4.3.1Bax基因通路機制 Bax為促凋亡基因，歸類為Bcl-2基因家族，能構成同源二聚體加速凋亡或異源二聚體克制細胞凋亡，通過二者的比例變化來影響細胞的凋亡[29]。當細胞接收到凋亡信號后，bax表達增加，作用表現在兩個方面：①與bcl-2形成同源二聚體加速凋亡；②同bcl-2結合成異源二聚體，降低bcl-2在細胞中的濃度，拮抗bcl-2的抑制凋亡作用。Bax基因表達的蛋白位于caspase3蛋白激活的上游，他將凋亡信號傳遞給下游的Caspase3，促使Caspase家族信號放大，最終誘導細胞凋亡[30]。Bax 是細胞線粒體凋亡通路的重要組成成員，與Bcl-2協同引起線粒體膜通透性改變，使跨膜電位消失，并釋放Cytochrome C，Cytochrome C和凋亡蛋白酶活化因子構成多聚復合體Apaf-1，又透過Apaf-1氨基端的Caspase聚集結構域使胞質中的Caspase-9 前體聚集，激活Caspase 級聯反應，激活下游Caspase-3 和 Caspase-7，完成其相應底物的剪切，引起細胞凋亡[31]。

4.3.2影響caspase 3表達 腫瘤的發生不僅是細胞增殖的異常，細胞凋亡通路也發生了改變，其中凋亡相關基因發揮了重要作用[32]。Caspase家族全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一組存在于細胞質中結構上相關的半胱氨酸蛋白酶[33]。

Caspase 3是Caspase家族中參與細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，分布于各種類型的細胞中[34]。Caspase 3主要是通過Fas/TNFR1介導的死亡受體途徑和線粒體途徑兩條通路介導細胞凋亡[35]。Caspase 3底物主要是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，也可參與U1-70K、DNA-PK、PKCd 和PKCq等底物的切割 。Caspase 3活化后直接參與切割細胞中相應底物的多種蛋白,最終導致細胞的程序性死亡[36]。

4.3.3抑制bcl-2通路機制 B淋巴細胞瘤-2基因簡稱bcl-2，Bcl-2基因是一種癌基因，它具有抑制凋亡的作用，BCL-2是最早發現的細胞死亡調節BCL-2蛋白家族的成員之一[37]。它與許多的癌癥類型，以及一些精神疾病和自身免疫性疾病有關。在癌癥中，BCL-2可阻止一些細胞(包括淋巴細胞)凋亡。

通路機制：①細胞發生凋亡的一個誘因證實可能為活性氧損傷造成但bcl-2的過表達可減少紙質過氧化物和氧自由基的形成[38]；②推測bcl2可能參與抑制鈣離子跨膜運輸；③bcl2蛋白在凋亡發生過程中表現為離子通道蛋白和錨定蛋白存在[39]。

本課題組在前期研究中發現，OA對肝癌模型動物腫瘤組織中Bax、bcl-2、caspase 3的表達具有一定的影響，對腫瘤的增殖和轉移具有一定的抑制作用，并呈劑量依賴，已有研究也已證實了OA可上調多種腫瘤組織中以上基因的表達有一定的影響。

4.4 誘導細胞周期阻滯

細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段，與腫瘤細胞的增長有密切關系。有研究表明齊墩果酸可以使肝癌細胞Hep3B細胞周期在G2/M期產生阻滯[40]。此外，還有一項關于骨肉瘤細胞的研究發現，OA可以使大量骨肉瘤細胞阻滯于G1期，這一過程是通過抑制G1到S期轉變的關鍵靶點cyclin D1而實現的[41]。細胞周期是受到多個調控因子和多個檢測點嚴密調控的，是一個有序而精確的過程，當這些調控因子和檢測點功能發生紊亂時，就會導致腫瘤的發生發展[42]。

4.5 OA對線粒體損傷及細胞內Ca2+水平的調節作用

線粒體是目前公認的最普遍的凋亡機制，一旦凋亡信號形成就會激發細胞質內Bal-2等促凋亡蛋白的形成，這些凋亡因子會轉移到線粒體進而誘導線粒體膜間質凋亡蛋白、細胞色素C的釋放。Ca2+水平是機體維持功能的重要因素。在正常生理狀態下,Ca2+在內質網內的水平高，一旦機體出現異常，細胞質內Ca2+水平激增并進入線粒體內部，促進細胞色素C的釋放或活化caspase-12前體，從而激活caspase-9，啟動凋亡程序。

5 結論

隨著國內近幾年肝癌的患病率的不斷增長，如何有效的抑制肝癌的發展，一直都是抗腫瘤藥物研發的重點和熱點。本文通過對齊墩果酸抑制腫瘤生長的多種作用機制的綜述回顧及展望，系統的闡述了齊墩果酸的藥理作用、對包括肝癌在內的多種腫瘤發生發展的抑制作用，對齊墩果酸作為抗腫瘤研發具有一定參考價值。