菠菜種質資源遺傳多樣性研究進展

孟淑春，徐秀蘋，宋順華，劉長江，馬連平

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心/農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室/農業部都市農業（北方）重點實驗室，北京 100097；2.中國科學院植物研究所系統與進化植物學國家重點實驗室，北京 100093）

菠菜（Spinacia oleraceaL.）原產伊朗，2000年前已有栽培。分東西兩個方向傳播，向東約于公元7世紀傳入中國，至今已有1 300多年的歷史。300年前再由中國傳往日本和東南亞各國，形成了東方系統的尖葉菠菜；西經北非、西班牙、德國，而后歐洲各國廣泛種植，并逐漸形成了歐洲圓葉系統菠菜。菠菜以葉片和嫩莖為食用器官，富含維生素和磷、鐵，世界各地普遍種植，是我國栽培和食用最廣泛的蔬菜之一，同時也是我國出口創匯的主要蔬菜之一[1]，種植面積僅次于大白菜、青花菜、甘藍，位居第4。據聯合國糧食及農業組織（FAO）統計，我國菠菜年產量約 2 500萬t，占世界菠菜總產量的 89.2%，是世界上最大的菠菜種植國家及消費國家[2]。

1 菠菜的種質資源

1.1 菠菜的分類

菠菜為藜科 （Chenopodiaceae）菠菜屬（Spinacia），根據其果實是否有刺，又分為有刺（var.spinosa Moench）和無刺（var.inermis Peterm.）2個變種。在我國栽培歷史悠久的中國菠菜，主要屬于有刺變種，這一類種質的主要特征包括葉片薄而狹小、較光滑、先端銳尖或鈍尖，葉柄長，栽培上稱“尖葉菠菜”；其生長較快，產量較低，耐熱性弱，耐寒力強，適合秋季栽培或秋播越冬栽培，代表品種有安徽尖葉、細葉角菜、慈姑葉、登高、全能等。另一類無刺菠菜種質，則表現為葉片肥大，橢圓形或卵圓形，先端鈍圓，褶皺較多，基部戟形，葉柄短，栽培上稱“圓葉菠菜”；與有刺變種相比，其耐寒力較弱，耐熱性較強，適合春夏或早秋栽培，代表品種有鹿邑圓葉、西安大葉、甘肅圓葉、日本大葉等。

1.2 菠菜的生物學特性

菠菜為一個栽培種（Spinacia oleraceaL.），染色體2n＝2x＝12。在印度和尼泊爾有其2個二倍體的近緣種，即S.tetandra和S.turkestanica[3]。圓葉菠菜的核型公式為2n＝2x＝12＝10sm+ 2st（SAT），屬3A型；尖葉菠菜的核型公式為2n＝2x＝12＝12sm（SAT），也屬3A型。除圓葉菠菜有一對近端部著絲點染色體以外，兩者的染色體數目及隨體數目與位置、核型類別皆相同，染色體長度比也幾乎相等。后來張長順[4]在菠菜中還發現了另外一種核型類別，即2n＝2x＝12＝2m（SAT）+10sm，屬2B型。

菠菜有較深的根，直根發達粗壯，呈紅色，味甜，可以食用，側根不發達，故不適宜移栽。菠菜營養生長期間為短縮莖，抽薹前葉片簇生于短縮莖上。生殖生長期間花莖伸長，花莖柔嫩時也可食用。菠菜多數為單性花，也有少數兩性花，一般雌雄異株，少數雌雄同株。雄花集成球形團傘花序，再于枝和莖的上部排列成有間斷的穗狀圓錐花序；花粉多，黃綠色，輕而干燥，屬風媒花。雌花團集于葉腋，無花被。兩性花自交或與同株上雄花交配均能結果。菠菜的果實在植物學上稱為“胞果”，內含1粒種子，被堅硬革質的外皮包裹。種子發育時果實上有刺，刺的多少和形狀各異。有些品種的刺不發達，形成無刺果實。內果皮木栓化，厚壁細胞發達，水分、空氣不易進入，所以種子發芽比較緩慢。菠菜播種用的“種子”實為果實。

菠菜植株按照性別類型可以分為5個類型：絕對雄株、營養雄株、雌雄異花同株、雌雄同花株和雌株。菠菜的性別分化受遺傳因子和環境條件共同作用控制和影響。在一般情況下，菠菜雌雄株比例相等，但依品種不同而有差異，如有刺品種絕對雄株較多，無刺品種營養雄株較多。

1.3 菠菜種質資源研究與利用

菠菜栽培歷史悠久，地域分布廣，種質資源豐富。目前，世界上已經被統計在冊的菠菜種質資源共計1 938 份[5]?？蒲泄ぷ髡邔Σげ俗隽硕喾矫娴幕A研究。菠菜葉片稍大、葉色深綠、單細胞所含葉綠體數目較多，且易于水培及葉綠體提??；因此，其種質資源常被廣泛用作植物分子生物學與光合作用機理研究的試驗材料。在酶工程研究方面，以菠菜為試驗材料，對谷氨酰胺合成酶的種類及亞基組成、醛縮酶的存在狀態及其活性、ATP合酶亞基N端與C端的功能及與植株性別相連鎖的同工酶譜帶的篩選等方面均有所報道[6]。國內外學者對菠菜種質資源的營養和品質進行了分析和比較。李錫香等[7]對42份來源于神農架及三峽地區的菠菜品種的還原型維生素C、粗蛋白質和草酸含量進行測定。趙清巖等[8]以引自內蒙古自治區和歐洲的4個菠菜品種為材料進行營養品質和生化測試，發現各品種間的營養成分含量差異顯著。

菠菜是雌雄異株作物，少量植株表現為雌雄同株。菠菜性型受遺傳因素和環境因素的共同影響[2]。對菠菜分子標記的研究主要集中在菠菜性型及抗病性上。李曉麗等[9]進行了菠菜四倍體誘導研究。國內外的育種專家針對被鑒定的菠菜病原菌生理小種尋找抗原，篩選抗病材料，培育抗病品種。Shi等[10]首次在菠菜上發現白銹病，隨后國內外廣泛報道。白銹病是在菠菜種植時比較常見的病害，容易導致菠菜減產，可以通過輪作和施藥等方式來防治。我國對菠菜的抗病性研究相對比較落后，主要是通過田間鑒定進行抗病品種選育。隨著生活水平的提高，市場對菠菜品種性狀要求也逐步提高，種質資源材料的限制加大了培育相關品種的難度；因此，對現有種質資源進行系統評價和鑒定，成為當前菠菜育種的首要工作。

2 基于形態學標記的菠菜種質遺傳多樣性研究進展

2.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性體現了物種的進化潛力和抵御不良環境的能力，是生態系統多樣性和物種多樣性的基礎，也是動植物育種和遺傳改良的基礎。作物品種間的遺傳變異，不僅存在于表型性狀上，而且存在于蛋白質和DNA等分子水平上。形態性狀包括葉片性狀、花的顏色、種子顏色及種皮表面紋飾等由單基因控制、不易受環境影響的質量性狀和由多基因決定的數量性狀。在天然種群中，單基因性狀少，主要用于研究基因流和選擇等進化因素。形態水平的檢測具有簡單、易行、直觀的特點，但可鑒別的位點比分子標記要少，鑒定周期長，而且受環境條件、操作技術等因素的影響，具有一定的局限性。

2.2 菠菜種質植株形態學遺傳多樣性研究進展

張南[11]用形態學標記將24份菠菜種質分成3個組群，基本可以把不同地理分布的菠菜種質區分開，同一來源地的種質被聚到了一起。吳婭妮等[12]對33份不同來源的菠菜種質資源植株的11個質量性狀和6個數量性狀進行了研究，發現材料間單株質量的變異系數最大，葉片長的變異系數最小。姚遠等[1]對40份來源不同的菠菜種質資源進行形態性狀的調查與分析，將其劃分為株型小、葉片小、單株鮮質量低、葉片無光澤、葉形多戟形的國內地方品種，和株型大、葉片大、單株鮮質量高、葉片有光澤、葉形近圓形的國外品種2類。

形態學標記分析遺傳多樣性主要依賴于人的主觀觀察、測量和統計。形態性狀調查的種類越少、權重越大，其對聚類分析結果的影響越大。只有當調查的性狀不經人的主觀選擇，做到無盡詳見時，才能真正反映其形態學上的遺傳多樣性。此外，形態學標記容易受環境因素的限制，部分性狀不能表達，使實際存在的某些性狀無法被發現，造成這些信息的丟失；但是，對形態性狀的調查和鑒定比起生物化學標記、分子標記來說更直接、簡便，很多性狀都能在田間進行直接的觀察和統計，利于在田間直接進行選擇，目前仍然是種質資源研究最基本的方法和途徑。

3 基于分子標記的菠菜種質遺傳多樣性研究進展

3.1 AFLP分子標記技術

基于DNA水平的分子標記是研究物種親緣關系的重要手段之一，是以生物大分子的多態性為基礎的一種遺傳標記。分子標記能反映生物個體或種群間基因組DNA間的差異。AFLP（amplified fragments length polymorphism）分子標記技術不需要了解基因組信息，分辨率較高、可靠性強、信息量大，因此非常適合遺傳多樣性的研究。洪棋斌等[13]用酶切和連接分步進行的方式建立并優化了大麥DNA單限制性酶切選擇性擴增多態性技術體系 （selective amplification DNA fragment，SADF）。和其他幾種標記相比，AFLP分子標記具有以下一些優越性：數量多，遍及整個基因組；檢測位點多，多態性高；在植物生長的不同階段，任何器官都可以用于AFLP標記檢測，不受環境限制，不存在是否表達的問題。隨著分子生物學的發展，分子標記技術也得到了相應的發展，各種DNA的檢測方法也隨之產生，如TE-AFLP（three endonuclease-AFLP）指紋技術、SDAFLP （second digestion AFLP）等。

3.2 AFLP在遺傳多樣性研究中的應用情況

目前，AFLP分子標記已被廣泛應用在遺傳圖譜構建、基因定位及克隆、物種的遺傳多樣性分析、種質和種子純度鑒定等方面。AFLP技術因其信息量大、多態性強，目前已廣泛應用到甘藍、辣椒、大白菜等多種蔬菜作物遺傳圖譜的構建上，而且趨勢越來越飽和化、實用化和通用化。AFLP標記是檢測種質遺傳多樣性和進行種質親緣關系分析的有效工具。昝逢剛等[14]采用AFLP技術對98份甘蔗種質資源進行UPGMA（unweighted pair group method analysis）聚類分析和PCA（principal component analysis）主要成分分析。許云等[15]采用AFLP標記對111份大薯材料進行聚類分析，利用多態性信息含量（PIC）、標記指數（MI）和解析強度（RP）分析不同引物組合的標記效率。此外，AFLP標記還被應用于蕪菁和大白菜、小白菜、甜瓜等蔬菜作物的遺傳多樣性和親緣關系研究中。

基因定位主要采用2種方法：一是利用近等基因系或分離群體分組法（bulked segment analysis，BSA）；二是根據已有的連鎖圖進行標記，利用目標基因有分離的F2群體進行基因定位。AFLP技術因其多態性豐富、檢測效率高、高效的多態性擴增產物，為尋找與目的基因緊密連鎖的分子標記提供了有力的工具。目前，利用AFLP 標記對馬鈴薯分離群體、西瓜野生種質抗枯萎病基因、番茄的葉霉病、灰霉病、晚疫病、白粉病抗性基因、黃瓜抗白粉病基因、大白菜根腫病抗性基因等一些抗性基因進行了定位。AFLP 的高度可靠性、方便性和快速、穩定的技術特點使其在分子生物學和遺傳育種研究中發揮著越來越重要的作用。

3.3 AFLP技術在菠菜遺傳多樣性研究中的應用進展

AFLP標記技術由于具有快速、靈敏、穩定、多態性檢出率高、重復性好等優點，被認為是一種高效的分子標記，尤其適合應用于基因組和轉錄組學研究基礎薄弱的物種。我國對菠菜種質資源收集、評價和遺傳多樣性研究開展得較晚，近年來陸續開始有了相關的報道。梅燚等[16]對AFLP反應體系的DNA用量、酶切連接、預擴、選擴等試驗條件進行了優化分析，初步建立適合于菠菜作物的AFLP反應體系；利用形態學分類法和AFLP分子標記技術對45份菠菜育種材料進行聚類分析，AFLP的聚類結果與形態學的分類結果基本一致，而且聚類結果與地域來源和形態特征有一定的對應關系[17]；吳婭妮等[12]對來自我國15個省份和地區的30余份菠菜的田間形態學性狀進行了調查和聚類分析，雖然供試材料來源僅限于國內，但材料間遺傳多樣性豐富。2000年以來，國內逐漸開始菠菜雜交育種方面的研究，但由于種質資源研究基礎薄弱，優良育種材料匱乏，新品種選育工作進展十分緩慢。

3.4 其他分子標記技術在菠菜遺傳多樣性研究中的應用進展

隨著分子生物學的快速發展，應用于菠菜上的分子標記技術也得到長足的發展，目前菠菜簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）已有所報道，Feng 等[18]從154個細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）末端序列中開發了100個SSR引物，能在菠菜中擴增出條帶，但均在抗霜霉病和感霜霉病位點上沒有多態性；潛宗偉等[19]利用MISA軟件對菠菜轉錄組SSR位點信息進行分析，開發適用于菠菜的SSR分子標記，在隨機挑選的218 對引物中有38 對表現多態性，菠菜的SSR擴增產物片段為101～277 bp。與AFLP 等相比，SSR具有數量豐富、分布廣泛、多態性高、多等位性、共顯性等特點，SSR更容易在菠菜分子生物學中被利用，但菠菜公開EST（expressed sequence tag，表達序列標簽）序列相對較少，開發的SSR標記相對數量不足，應用較為困難。相對于其他植物，菠菜的SSR多態性較低，這可能與菠菜的DNA轉錄序列的保守性相關。

2017年，上海師范大學生命與環境科學學院植物種質資源開發中心王全華研究員課題組和美國康奈爾大學費章君教授課題組聯合發布了一個新的菠菜栽培種基因組草圖，同時對120份野生和栽培菠菜進行了轉錄組變異等分析，結果顯示：菠菜基因組全長1 009 Mb，富含重復序列，編碼25 495個基因[20]。研究小組通過對轉錄組變異分析發現，與其他蔬菜作物 （如番茄和黃瓜）不同，栽培菠菜品種的遺傳多樣性與其野生祖先沒有太大差異，說明菠菜的馴化經歷了較弱的瓶頸效應。這意味著菠菜的遺傳改良還有很大的空間，而同時也給利用更精確的基因組標記來加快育種進程增加了困難。該研究產生的基因組序列和轉錄組變異數據為促進菠菜研究和育種改良提供了重要資源，可用于培育抗病性更強、產量更高、品質更好的菠菜品種。

4 菠菜種質資源遺傳多樣性研究展望

菠菜是一種重要的蔬菜作物，以葉片和嫩莖為食用器官，目前在世界各地普遍種植，同時也是我國主要的出口蔬菜和分布普遍、食用廣泛的綠葉蔬菜之一。國外菠菜育種以雜種優勢利用為主，而國內傳統的菠菜育種一直停留在從常規品種、地方品種或國外引進品種中進行選育，菠菜的基礎研究仍相對薄弱。菠菜強大的市場需求與其較不完善的種質相關研究間形成了鮮明的矛盾，從而進一步影響菠菜在我國的推廣和發展。如何更有效地利用豐富的菠菜種質資源、挖掘優異種質和基因為新品種選育和種植生產服務，將成為我國菠菜雜交育種工作的重中之重。