葡萄抗寒機制研究進展

焦曉博，紀薇*（山西農業大學園藝學院，山西太谷 030801）

葡萄（Vitis viniferaspp.）因其果實風味獨特，富含大量營養物質，已成為當今世界最受歡迎的果品之一[1-2]。世界糧農組織的統計（http://faostat.fao.org）2018年我國葡萄種植面積為87.5萬 hm2，產量約為1500萬 t，歐亞種和歐美雜交種為主栽品種。葡萄主要分布于北緯25～45°的干旱或半干旱地區[3]，對主栽區的低溫干旱氣候適應性較差，極易引發冷害和凍害[4]。因此，由低溫引起的冷害和凍害問題是我國尤其是北方地區葡萄生產面臨的主要風險[5]。

北方季節更替引發的低溫冷害通過降低植物的光合作用、細胞膜流動性及基礎代謝等，從而影響葡萄枝干及芽的生長發育，造成減產，也可能造成葡萄新梢、花芽及葉片的凍害，嚴重影響該年樹體的成長以及果實產量，嚴重凍害則直接導致葡萄芽、枝干以及根等器官的損傷，甚至死亡[6]。近年來，由低溫引起的凍害問題發生頻繁。2008年賀蘭山東麓葡萄冬季凍土層可達85 cm，造成大面積減產，幼齡葡萄樹大量死亡，有些葡萄園的死亡率甚至高達60%[7]。2010年，賀蘭山東麓地區由于春季土壤溫度過低，葡萄發芽比歷年推遲15 d左右，幼樹枝蔓抽干嚴重，導致大量幼樹死亡[8]。2012年，受降雪低溫影響，甘肅威龍釀酒葡萄基地遭受晚霜凍害的面積近53.33 hm2[9]。2017年，山西省迎來強降溫天氣，多地區遭受嚴重低溫災害，課題組對此展開調查，受災地區葡萄的花器官受害最為嚴重，導致產量嚴重下降。面對此類問題，生產中多采用下架埋土的防寒辦法，但其繁重的工作量往往需要投入大量的人力物力，極大增加了葡萄的生產成本，對我國葡萄產業的可持續發展十分不利[10]。

低溫傷害已對我國葡萄主產區造成了巨大的經濟損失，極大地限制了我國北方地區葡萄產業的發展，且其發生頻率和破壞程度日益嚴重，使整個產業面臨嚴峻的挑戰[11]。隨著科技的進步和分析手段的迭代更新，植物對低溫脅迫的響應機制在各個層面都得到了廣泛而深入的研究。本文對近年來葡萄抗寒種質資源、生理機制、分子機制及防寒措施等方面進行總結概述，并提出了對未來葡萄產業發展的展望。

1 葡萄抗寒種質資源

葡萄屬于喜溫果樹，其生長發育對熱量需求較高，但不同品種株系對熱量要求還存在著差異[12]。在北方冬季休眠期，美洲種或歐美雜交種的枝條較歐亞種的枝條更加耐受低溫[3]。樊秀彩等[13]為探究不同葡萄品種的抗寒性，于2010年春季對鄭州果樹所資源圃中1000份種質的萌芽狀況進行了統計，結果表明歐亞種的抗寒性最差，而美洲種群、美洲雜種種群及山歐雜種種群的抗寒性最好。

北美東部是最早進行葡萄抗寒育種的地區，其育種方式主要為野生種馴化或種間雜交。經不懈努力育出了如‘伊莎貝拉（Isabella）’‘卡托巴（Catawba）’‘康可（Concord）’‘Ontario’‘金玫瑰（Golden Muscat）’‘Buffalo’‘Alden’‘Bath’‘喜樂無核（Himrod）’‘Romulus’‘布朗無核（Bronx Seedless）’‘Suffolk Red’‘康能無核（Canadice）’‘加拿大玫瑰（Canada Muscat）’‘紐約玫瑰（New York Muscat）’‘Cayuga White’‘Horizon’‘Traminette’等抗寒葡萄品種[14]。俄羅斯、加拿大和日本等國家也在抗寒葡萄品種的培育方面做出了巨大貢獻。俄羅斯和前蘇聯的育種家們經不懈努力先后培育出‘北方葡萄’‘北方曙光’‘北極’‘布圖爾’‘米丘林科林斯’‘農莊’‘金屬’及‘俄羅斯康克’等抗寒性強的品種[15]。加拿大育種家也成功育成了釀酒品種‘L'Acadie’和鮮食品種‘Vanessa’，可分別耐受-31 ℃和-26 ℃的低溫[16]。日本的抗寒品種培育主要集中于巨峰系，如‘紅富士’‘先鋒’‘巨峰’‘蜜汁’等，其中‘蜜汁’具有良好抗寒性，在我國東北地區廣泛種植[14]。

國內的抗寒葡萄研究主要集中于山葡萄（V. amurensisRupr.）和‘貝達’等抗寒砧木[12,17]。在我們已知的葡萄種群里山葡萄抗寒性最強，最低能夠耐受-50～-40 ℃的超低溫，被廣泛用作雜交親本[18]與栽培品種雜交，并選育出了一批抗寒能力強的品種。例如，中國科學院植物研究所以‘玫瑰香’葡萄作母本，山葡萄作父本培育出抗寒優質的釀酒葡萄品種‘北紅’和‘北玫’，在我國北方地區可直接露地越冬[19]。因此，合理利用并推廣優質抗寒種質資源，對我國葡萄栽培與果品改良具有廣闊的應用前景[20]。

2 葡萄抗寒生理機制

植物組織在受低溫脅迫時，可通過改變其組織結構、生理和生化指標來抵御逆境環境。為了揭示葡萄在低溫脅迫下的抗寒生理機制，國內外研究人員對葡萄的組織結構和生理生化指標進行了大量研究分析。

低溫導致胞內結冰，使得細胞膜由液相向固相轉變，降低膜結構的流動性，并進一步激活和引起胞內低溫信號的傳遞，細胞質中Ca2+濃度的升高是植物響應低溫脅迫的初級反應[21-22]。低溫刺激質膜上Ca2+通道，通過影響其活性導致細胞膜僵化，使得細胞質中Ca2+濃度提高，從而激活下游相關信號[23]。對苜蓿和擬南芥進行低溫脅迫后發現，細胞質Ca2+濃度與冷誘導轉錄產物的累積呈正相關[24-25]。

葡萄在面臨低溫環節的威脅時，其細胞質膜滲透性提高，導致電解質外滲，電導率增大，在一定程度上與其抗寒性呈負相關[26]。任群紅等[27]、馬小河[28]等利用梯度低溫處理對不同葡萄品種的一年生枝條進行電導率測定，發現隨處理溫度的降低，各葡萄品種相對電導率均呈現出較顯著的遞增趨勢，電解質滲出率變化基本呈“S”型曲線分布，并結合Logistic方程擬合計算其半致死溫度，得到其抗寒性的強弱排序。在低溫脅迫下，葡萄植株通過增多或形成滲透調節物質來提高細胞質濃度，降低水勢，促進吸水，使植株能夠正常生長[29-30]。調節滲透性的主要物質有脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等[31]。施明等[32]研究發現，隨著溫度的降低，葡萄體內的脯氨酸積累量呈增加的趨勢。處于低溫環境中的葡萄植株，其體內可溶性蛋白含量也會隨著溫度的變化而有所變化[33]。李桂榮等[34]對4個無核葡萄品種的抗寒性進行研究，發現可溶性蛋白的含量隨著低溫逐步上升。在冷脅迫下，葡萄植株體內的多糖被水解為可溶性糖，不僅提高了細胞質的滲透勢而且降低了冷凍溫度[35]；葡萄植株的抗寒能力隨著可溶性糖含量的增加而增強，因此，植物還可通過提高體內的可溶性糖含量降低低溫對植物體的傷害，從而適應低溫環境[36]。因為丙二醛（MDA）是膜脂過氧化反應后的主要產物，因此其含量高低能作為評價膜系統受損程度的重要指標。魯金星等[37]通過對多個葡萄品種進行抗寒性鑒定分析發現，植株抗寒性與MDA含量呈負相關。

葡萄植株體內的活性氧化酶系統（CAT、SOD、POD）通過調控來保護植株，減輕低溫對植株的損害。王淑杰等[38]發現，葡萄植株內的酶活性強弱與其抗寒性呈正相關，且在低溫脅迫下，抗寒性弱的品種比抗寒性強的品種的酶活性下降速率快。但魯金星等[37]通過對不同砧木和釀酒品種進行抗寒性測定，發現在一定溫度限度內枝條POD活性與其抗寒性呈正比，而隨處理溫度降低，SOD和CAT活性表現出先上升后下降的變化趨勢。活性氧化酶作為植物體的保護酶，通過清除活體氧和自由基，減少或避免活性氧和自由基對細胞膜的損害，從而使植物體具備一定的抗寒性。

3 葡萄抗寒分子機制

隨著葡萄抗寒生理生化特征的深入研究，分子生物學方法也逐漸成為葡萄抗寒性研究的重要手段，利用該技術進一步挖掘葡萄在低溫脅迫下信號轉導和物質代謝通路中關鍵的調控和參與基因，且對其抗寒性進行良性改良，該技術在葡萄抗寒性鑒定與育種方面的應用前景十分廣闊[39-40]。目前，植物響應低溫脅迫信號機理的研究在擬南芥中較為集中，而葡萄耐寒分子機制的研究基本上處于發展階段，對于具有優秀抗寒能力的山葡萄品種，已經完成了對其抗寒相關基因CBFs和ICE1的克隆和功能驗證[41-45]。

此外，Xiao等[46]分離了歐亞種葡萄與河岸葡萄的CBF/DREB1-like基因CBF1-4，發現低溫處理后CZBF4表達量上升且能夠維持一定的水平，據此推測其可能與葡萄抗寒相關；Li等[47-48]從‘玫瑰香’葡萄中克隆得到了ICE1和HOS1兩個基因，并通過擬南芥轉基因系統驗證了其在低溫脅迫響應中的功能；Xu等[49]通過對該基因的兩個同源物VaICE1和VaICE2與其他植物ICE1基因的比對，分析表明，VaICE1和VaICE2在控制抗寒性表達的早期過程中起關鍵調節劑的作用，并且調節影響CBF途徑的各種低溫相關基因的表達水平；通過將VaICE1克隆到含有CaMV35S啟動子的載體pCAMBIA1300中構建過表達載體，并在煙草中進一步得到驗證[50]。范高韜等[17]利用轉錄組技術鑒定出一個名為VvCOR27的抗寒候選基因，并將VvCOR27超表達的轉基因擬南芥株系做了耐寒檢測，結果表明：VvCOR27參與了植株對低溫脅迫的響應，并對植物的耐寒性具有正調控作用。據有關文獻證明，bHLH家族參與許多物種的非生物脅迫耐受性調節，如Wang等[51]對94個葡萄bHLH基因進行基因組鑒定及系統發育分析以評估這些基因之間的關系，并分析了94個葡萄bHLH基因在寒冷脅迫條件下的各種組織表達模式，鑒定了可能與花色素苷和黃酮醇生物合成相關的3個葡萄bHLH基因，從而確定了bHLH轉錄因子與葡萄耐寒性的潛在相關性。冷適應蛋白（cold-regulated，COR413）在植物的耐寒性調節中扮演著重要角色，抗寒性極強的山葡萄中COR413蛋白家族的4個成員，相對于易受低溫傷害的歐洲葡萄相應的COR413蛋白家族成員在進化中的表現更為保守，且由于山葡萄和歐洲葡萄的種間差異，COR413蛋白家族成員在兩者中的表達模式有著明顯的差別，參與低溫脅迫的表達模式也有差異，其山葡萄VvCOR413-IM1對低溫脅迫響應誘導表達顯著，因此極為可能與抗寒代謝響應密切相關[52]。

新興分子生物技術的發展推動著葡萄抗寒分子機制研究的進步。Deng等[53]采用基于iTRAQ的比較蛋白質組學分析方法，通過對耐寒葡萄品種‘山葡萄’（Vitis amurensis）和冷敏葡萄品種‘玫瑰香’（Vitis viniferacv. Muscat Hamburg）進行冷應答蛋白鑒定，發現參與光合作用、淀粉和蔗糖代謝的蛋白質對刺激的響應（如富含甘氨酸的RNA結合蛋白、鈣調蛋白、WSI18蛋白等）進行的信號轉導可能對葡萄起到抵御寒冷的重要作用；米寶琴等[54]利用抑制性消減雜交技術（SSH），成功的把山葡萄株系‘通化-3’與歐洲葡萄‘紅地球’分別作Driver與Tester，制作了ASSH與SSSH兩個cDNA的表達文庫，經DNAMAN和BLAST比對，篩選出了多個與山葡萄抗寒性相關的ESTs。此外，利用分子標記輔助育種和構建遺傳圖譜進行的研究也非常多。張劍俠等[55]選取抗寒性不同的83份葡萄資源以及3個雜交組合進行試驗，獲得了2個和野生山葡萄抗寒基因連鎖的RAPD標記S241-670與S238-800；劉鎮東等[56]利用SRAP和SSR技術對‘紅地球’‘雙優’和‘北冰紅’3個葡萄品種進行了分子遺傳圖譜的構建和抗寒性QTL定位，為今后抗寒基因的進一步研究和分子標記輔助育種提供了扎實的理論基礎[57]。

4 葡萄抗寒防凍措施

低溫凍害的發生機制復雜，雖然出現頻率較低，但一旦發生不僅影響范圍大、受災作物廣，且減產幅度大，損失極為嚴重。因此，在北方低溫環境下種植葡萄必須加強防凍措施，多舉措提高葡萄抗寒性顯得極為關鍵[58]。

經眾多實踐探索，我國北方常采用的防凍措施主要包括冬季埋土、樹干涂白、冬灌冰層、冬季覆雪，覆蓋玉米秸稈、防凍膜、保溫被、地膜等防寒物等[10,59]。高美英等[10]在晉中地區以塑料大棚內5年生歐亞種葡萄品種‘早黑寶’為試驗材料，以7種防寒措施為處理和以自然越冬為對照，結果表明在北方寒區塑料大棚內莖干裹覆黑膜的防寒效果最好，而露地栽培則需覆蓋保溫被。劉志虎等[60]在施肥方式和栽培環境對葡萄抗寒性的影響，以及理土方式與越冬能力等方面的研究得到，在保持一定濕度土壤條件下，采用瓦楞紙覆蓋可使土壤溫度保持穩定，深施基肥可提高葡萄越冬的安全性。陳淑麗等[61]研究發現，采用棉被覆蓋的效果顯著高于玉米秸稈加覆膜和埋土。吳亮等[62]研究表明，玻璃棉保溫被的防寒效果顯著優于埋土的防寒效果。李欣等[63]研究表明，在寧夏賀蘭山地區使用聚苯乙烯泡沫顆粒保溫被覆蓋防寒可以使葡萄安全越冬，且來年發芽情況良好。劉俊等[64]研究表明，棉被覆蓋和黑膜+30 cm玉米秸兩種越冬方式可使葡萄在河北地區安全越冬，其中黑膜+30 cm玉米秸較其他越冬方式便宜，可推廣于生產。王進等[65]以單層草簾、雙層膜（白膜+黑膜）、單層白膜（普通地膜）和單層黑膜為試材，模擬冬季有無積雪覆蓋兩種情況，通過低溫變化得出，在新疆天山地區冬季3個月內，4種越冬措施都可以有效穩定地溫波動，其中有積雪覆蓋的單層草簾處理的效果最好，最低溫度不低于-1.5 ℃。

葡萄越冬的防寒措施需根據各地區的氣候特點進行設計，并使用不同防寒材料進行包裹或覆蓋，減少春季晚霜和秋季早霜的傷害，提高葡萄的果實產量和品質。因此，新的防寒措施和材料的開發利用，將為北方寒區葡萄產業的蓬勃發展提供助力。

5 結語

目前，眾多科學家對葡萄抗寒性的研究方興未艾，已從簡單的逆境生理試驗發展到了生物技術領域的研究，為葡萄抗寒內在機理提供了堅實的理論基礎。通過引種馴化以選育各地區適宜的抗寒葡萄品種，或者采用抗砧嫁接等農業措施可以從不同方面有效提升葡萄耐寒能力。因此，今后應著重注意抗寒種質資源的選擇與培育，并采用更多的方法與手段對各葡萄品種進行準確的抗寒性鑒定，推進葡萄抗寒機制的研究，為確定其環境適應性提供理論依據。同時，還應在大量生理研究的基礎上，加強對基因組學、代謝組學及蛋白組學等方面的廣泛研究，更深入的探索葡萄遺傳多樣性，發掘更多有效的抗寒相關基因，促進對葡萄抗寒性的認識以及抗寒分子育種的發展。