葡萄霜霉病抗性育種研究進展

付晴晴，褚燕南，王躍進，徐炎*

（西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100）

葡萄霜霉病（Grape downy mildew）是由葡萄霜霉菌[Plasmopara viticola(Berk. & M. A. Curtis)Berl. & De Toni]引起的典型流行性病害[1]，遍及世界各葡萄產區，以多雨潮濕地區發生普遍[2-3]，是危害葡萄最重要的病害之一。葡萄霜霉菌多侵染葡萄葉片，也可感染新梢、幼嫩果實等組織，病菌從侵入寄主到發病僅需3～5 d，在條件適宜情況下，從田間出現中心病株到大面積爆發只需10～15 d[4-5]。據國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）數據顯示，中國2018年的葡萄種植面積達87.5萬 hm2，占世界葡萄種植面積的12%，僅次于西班牙，而葡萄產量居于世界首位[6]。目前，有關葡萄霜霉病傳入我國的時間和途徑尚不清楚，但最早的記載出現于1899年。現在霜霉病在我國各葡萄產區均有分布，以河北和山東發病最為嚴重，引起的葡萄減產在一般年份約有10%～20%，而在霜霉病流行年份能達到50%～80%，甚至絕產[7]，給葡萄生產造成嚴重經濟損失。在新世界釀酒葡萄產區澳大利亞，平均每年因葡萄霜霉菌造成的產業損失高達6300萬美元[8]，相當于澳大利亞葡萄生產總值的1%[9]。生產上的一些農業手段包括夏季修剪、提高結果部位、合理負載量、科學肥水管理、冬季清園以及采用避雨栽培等措施雖然能在一定程度上減輕葡萄霜霉病的爆發，但由于化學藥劑具有見效快、效果顯著、使用方便等特點，所以，目前防治葡萄霜霉病依然過度依賴化學殺菌劑的使用。歐盟統計局2007年的統計結果顯示，在1999—2003年，歐洲葡萄的栽培面積僅占總種植面積的5%，然而卻使用了近60%的殺菌劑[10]。值得注意的是，化學農藥的長期使用既危害環境又耗費人力物力，并且化學農藥極易導致霜霉菌產生耐藥性，對防治病害帶來嚴峻挑戰[11-12]。選用抗性品種是葡萄霜霉病防治的重要途徑，也是最為經濟有效的方法[13-14]，而開展葡萄霜霉病的抗性研究及抗病機理探討，對指導葡萄抗病育種具有重要意義。本文根據前人的研究報道，對葡萄霜霉菌的研究現狀進行了分析探討。

1 不同野生種葡萄對霜霉菌的抗性

葡萄不同種類對霜霉菌表現出較大的抗性差異[15-17]。大量研究表明，歐洲葡萄（V. viniferaL.）栽培種均不抗霜霉病。因此，在葡萄屬的野生種中尋找抗病資源成為各國學者的研究熱點。原產美洲的圓葉葡萄（Muscadinia rotundifoliaMichx.）雖然對霜霉菌免疫[18-20]，但遠緣雜交不親和限制了其進一步發展。中國是葡萄屬野生種的重要起源地之一，擁有豐富的抗病種質資源，賀普超等[21]對我國葡萄野生資源進行了收集和保存，并通過田間調查和接種，以及室內離體接種等方法研究了中國野生葡萄對霜霉病的抗性。結果表明，對葡萄霜霉病的抗性在不同株系間存在顯著差異，其中復葉葡萄‘留壩-8’（V.piasezkii accessionLiuba-8）、瘤枝葡萄‘嵐皋-5’（V.davidiivar.Cyanocarpa accessionLangao-5）為高抗葡萄霜霉病株系；華東葡萄‘白河-35-1’（V. pseudoreticulata accessionBaihe-35-1）為抗霜霉病株系[15,21-22]。Liu等[23]和Yin等[24]通過苯胺藍和3-二氨基聯苯胺（diaminobezidin，DAB）染色等方法發現與歐洲葡萄‘黑比諾’相比，高抗霜霉病的‘留壩-8’和‘嵐皋-5’菌絲生長緩慢，孢囊梗和孢子囊的萌發量較少，侵染位點周圍有大量的胼胝質沉積和H2O2的積累，進一步驗證了前期賀普超等人的研究結果。原產于東亞的山葡萄對霜霉菌抗性也表現出明顯差異[25]，通過葉圓盤接種試驗表明，山葡萄‘左山二’（V. amurensis Rupr. cv. Zuoshan-2）對葡萄霜霉菌有一定抗性，而山歐雜交種‘左優紅’表現易感霜霉菌[26]。

2 葡萄對霜霉菌抗性機理

2.1 植物-病原菌互作機理

植物病原菌進化出多種策略以侵染寄主，例如粘附于植物表面、消除或逃避植物響應感染產生的防御分子以達到侵染目的[27]。同時，植物進化出精密的防御系統，從而識別病原菌分子并產生防御反應。植物具有不同的組成型防御機制，如細胞壁和角質層作為物理屏障以逃避病原菌入侵[28-29]。一旦植物的結構屏障被破壞，植物便通過誘導防御反應防止病原菌進一步入侵[30]。

植物已經進化出兩層防御系統：首先，通過寄主細胞表面的模式識別受體（pPRR）、識別微生物相關分子模式（MAMP）或病原菌相關的分子模式（ PAMP），即PAMP-激發的免疫（PTI）或MAMP-激發的免疫（MTI）[31-32]。PTI啟動一系列基礎防御，包括活性氧（ROS）積累以及胼胝質沉積來增強細胞壁[33-34]。然而，一些病原菌進一步進化以釋放抑制PTI的效應因子，破壞寄主免疫反應從而促進病原菌定殖[35-36]。在宿主與病原菌的進化斗爭中，植物進化出第二層防御系統，通過細胞內受體識別胞內效應因子，觸發效應因子激發的免疫（ETI）反應[37-38]。細胞內受體主要是富含核苷酸結合-亮氨酸重復（NB-LRR）的R蛋白，通過復雜的機制直接或間接識別病原菌效應因子[37]。R蛋白一旦被效應因子激活，便可引起強烈的防御反應，包括ROS快速爆發、水楊酸積累、侵染位點的過敏反應（HS）及病程相關蛋白（PR）基因上調表達。ETI啟動與復雜防御信號傳導途徑網絡相關，導致防御性細胞反應和大規模轉錄重編程事件[39]。

2.2 葡萄抗霜霉病基因功能分析

相較于歐洲葡萄，美洲葡萄及中國野生葡萄具有更高的葡萄霜霉菌抗性。基于此，國內外學者利用組織學、細胞學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等方法研究了葡萄-葡萄霜霉菌互作關系，揭示了葡萄抗霜霉病作用機制。

植物通常利用多種因子相互作用共同抵抗病原菌入侵。大量研究發現，葡萄葉片和漿果中的白藜蘆醇、紫檀芪、ε-和δ-葡萄素能夠抑制葡萄霜霉菌生長[40-43]。另外，木質素和萜類化合物也在抗葡萄霜霉病反應中發揮重要作用[44-46]。

近年來，轉錄組、蛋白組和代謝組學的出現加速了葡萄與葡萄霜霉菌互作的研究。Figueiredo等[47]通過轉錄組和代謝組分析發現，抗病葡萄中編碼枯草桿菌蛋白酶、苯丙氨酸裂解酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、類WD-重復蛋白和J2P基因表達上調，以及肌醇和咖啡酸的積累。接種葡萄霜霉菌的山葡萄‘左山-1’（V. amurensisRupr. cv. Zuoshan-1）已通過轉錄組測序鑒定出一系列可能引起寄主抗性的基因和通路，這些基因包括CHI4D、TL3、PR10、CYSP、ERF4、STS5、THX、SHM1、HypP、GLO、ClpP等，涉及的途徑與核糖體結構、光合作用和糖類代謝等有關[48]。

Marianna等[49]使用Combimatrix微陣列芯片技術比較了霜霉菌侵染后的美洲種河岸葡萄（V. ripara）與歐洲葡萄（V. vinifera）初期轉錄本變化，挖掘出的一些候選抗性基因涉及病程相關蛋白、苯丙烷類化合物、信號轉導級聯組分和茉莉酸等。Malacarne等[50]進行了葡萄種群的代謝和轉錄分析，發現抗病葡萄中積累反式-白藜蘆醇、反式-白藜蘆醇苷、反式-紫檀芪和多達13種不同葡萄素，以及參與特異轉錄防御反應、光合作用、初級和次級代謝、信號轉導和運輸等基因。上述葡萄與霜霉菌的互作均基于不同抗病葡萄與混合霜霉菌。Li等[51]分析兩種葡萄霜霉菌分離菌與葡萄的互作，發現在非親和互作中抗性相關基因、信號傳導相關基因、激素相關基因、病程相關蛋白基因以及與防御相關代謝物合成相關基因，如苯丙烷類/芪類/類黃酮合成基因在感染早期表達更高。Xu等[52]通過蛋白質組分析表明，在霜霉菌侵染后抗病葡萄中通過下調表達光合相關蛋白和ATP合成酶來限制病原菌生長，而上調表達PR10蛋白來限制葡萄霜霉菌侵染范圍。Nascimento-Gavioli等[53]研究表明，含有Rpv1和Rpv3基因位點的葡萄對霜霉菌的抗性反應主要涉及氧化還原和能量代謝，尤其是L-抗壞血酸降解途徑。Ma等[54]研究表明，葡萄霜霉菌入侵葡萄葉片后，VpPR10.1與VvVDAC3蛋白相互作用，增大線粒體膜孔通道，細胞色素C釋放到胞質中，激活Metacaspase基因表達，誘導病原菌入侵部位細胞死亡，抑制病原菌生長，阻止葡萄霜霉菌的進一步侵染。

3 葡萄霜霉菌效應因子致病機理

細菌、真菌或卵菌等病原菌對植物的侵染依賴于一種稱為效應因子的致病性因子，這種效應因子能分泌效應蛋白改變宿主的新陳代謝，以達到成功侵染寄主的目的[55]。因此，研究葡萄霜霉菌效應因子致病機理，探究葡萄-病原卵菌互作的分子機制對抗病育種具有重要的意義。科學家們通過轉錄組和全基因組測序手段獲得了大量的候選效應因子，但大多數的效應因子作用機制尚不清楚，尤其對葡萄霜霉菌效應蛋白的研究還處于起步階段。葡萄霜霉菌效應蛋白主要包括兩類：一類是具有RxLR基序的效應因子，另一類是類似于RxLR的Crinkler（Crinkling and necrosis protein，CRN）效應因子。

3.1 葡萄霜霉菌RxLR類效應因子

RxLR類效應因子是根據位于效應蛋白的N-末端區域保守的RxLR（Arg-X-Leu-Arg）序列以及其下游5～25個氨基酸的dEER（Glu- Glu-Arg）基序命名[56-57]。RxLR基序可能負責將效應蛋白從卵菌和真菌轉移到寄主細胞內[58-59]。

近幾年，有關葡萄霜霉菌RxLR類效應因子的研究進展迅速。Mestre等[60]首次通過葡萄霜霉菌萌發的游動孢子構建了表達序列標簽（EST）文庫，并從中篩選出26個特異表達的分泌蛋白，其中有2個RxLR-dEER效應蛋白，通過半定量PCR分析發現在侵染早期有高表達。Yin等[61]對“ZJ-1-1”“JL-7-2”和“CSRIO-L-2”三個葡萄霜霉菌小種的轉錄組數據分析，發現了3萬多個霜霉菌基因受到誘導表達，進一步鑒定了51個RxLR類效應蛋白，并且發現這些效應蛋白均能抑制由BAX和INF1引起的細胞死亡。隨后，Mestre等[62]又通過平行轉錄組測序法挖掘到50個RxLR類效應蛋白。Xiang等[63]對克隆到的23個RxLR效應因子進行本氏煙草瞬時表達發現，只有PvRxLR16可以引起煙草葉片細胞死亡，17個可以完全抑制不同激發子誘導的煙草葉片細胞死亡，5個部分抑制細胞死亡，表明葡萄霜霉菌能夠通過分泌RxLR效應因子進而抑制PTI、ETI和其他類型的免疫反應。進一步研究發現，PvRxLR16存在W/Y/L基序和一個預測的N-糖基化位點，點突變糖基化位點后不能引起細胞壞死，病毒誘導的基因沉默發現PvRxLR16功能依賴于SGT1、Hsp90和RAR1介導的信號轉導，而不是Serk3/Bak1[64]。意大利的Brilli等[65]通過全基因組測序，從“PvitFEM01”葡萄霜霉菌數據庫中鑒定了58個候選RxLR效應因子，其中一個編號為PVITv1008311效應因子能夠引起河岸葡萄葉片的HR反應，而在歐亞種葡萄中未出現防衛反應引起的細胞壞死。Lan等[66]的研究發現，葡萄霜霉菌效應因子PvRxLR131通過靶向植物受體樣激酶抑制劑BKI1抑制植物免疫以促進病原菌侵染，在本氏煙草中沉默NBBKI1，PvRxLR131的毒性喪失，說明PvRxLR131效應因子的活性是由BKI1介導的；PvRxLR131-轉基因植株表現出BKI1過表達的的矮化表型，抑制了油菜素內酯（BR）和ER（ERECTA）信號轉導。

3.2 葡萄霜霉菌CRN效應因子

CRN蛋白家族最初在致病疫霉中被鑒定，并根據其分泌蛋白在植物中異位表達所呈現的特征性葉片皺縮而命名。CRN效應蛋白在植物致病卵菌和共生真菌中普遍存在，是胞內效應因子的第二大類效應蛋白[67]。與RxLR蛋白類似，CRN蛋白家族中的成員也是模塊分子，包含信號肽，保守的N末端氨基酸基序：LXLFLAK，其后是保守的DWL結構域和HVLVVVP基序以及高度多樣化的C末端區域，并且可能通過N-和C-末端區域的重組而發生變異[68-69]。

目前，關于葡萄霜霉菌CRN效應因子的報道較少。2016年，Mestre等通過葡萄霜霉菌轉錄組數據庫外挖掘到60個CRN效應蛋白[62]。Brilli等[65]從葡萄霜霉菌“PvitFEM01”的全基因組測序結果中挖掘到58個CRN效應蛋白，qRT-PCR結果顯示其受葡萄霜霉菌誘導表達。到目前為止，關于葡萄霜霉菌CRN效應因子的功能等研究還未見報道。

4 分子標記輔助抗霜霉病育種

長久以來，培育優質高抗的新品種一直是葡萄育種工作者的研究目標。利用分子標記輔助選擇的分子標記輔助育種技術是葡萄抗病分子育種的重要手段，其目的是將不同的抗性位點結合起來，以獲得持久的抗性。利用分子標記對抗性基因進行標記，并了解其功能，是培育持久抗性品種的關鍵[70]。

葡萄霜霉菌屬于微效多基因控制的數量性狀[71]，中國野生種葡萄存在抗葡萄霜霉病的主效基因[72]，利用高抗的中國野生種葡萄與優質的歐洲種葡萄雜交而培育抗霜霉病品種是育種工作的重要研究任務。近十幾年來，分子標記輔助育種取得了很大的進展。羅素蘭等[73]利用Wizard DNA Clean-up System純化回收抗葡萄霜霉病主效基因連鎖的隨機擴增多態性DNA（RAPD）標記OPO 06-1500，并進行序列分析，為抗病雜種早期鑒定、DNA探針合成及獲得抗霜霉病基因提供依據。簡單重復序列（SSR）標記因其可靠性高、穩定性好、成本低等特點，在遺傳定位、種質鑒定、標記輔助選擇等領域得到了廣泛應用，是理想的分子遺傳標記。隨著基因組測序的快速發展，廣泛分布在葡萄基因組中的高度多態性SSR分子標記已被應用到種質資源遺傳連鎖分析和數量性狀位點（QTL）定位[74-75]。葡萄霜霉菌的數量性狀位點已經被鑒定，并且獲得了抗葡萄霜霉病性狀的基于種群分離的分子圖譜，并將這些抗霜霉病的QTLs命名為Rpv（Resistance toP. viticola）。到目前為止，已經在4、5、6、7、8、9、11、12、14、17和18號染色體上鑒定出27個位點（Rpv1-Rpv27），它們在不同的遺傳背景下賦予對葡萄霜霉病的抗性[76-79]。基于此，Zhao等[80]選擇30個SSRs和抗性基因類似物（RGAS）標記，對120個葡萄野生種質資源的霜霉病抗性進行了定量分析，獲得一批對葡萄霜霉菌高抗的野生葡萄株系（如云南元謀-2、云南-2、木札嶺-3等）。

5 展望

綜上所述，葡萄抗霜霉病屬于多基因控制，有多種組分參與抗病性，野生抗病葡萄種質資源抗病作用機制還不清楚，目前利用抗病種質通過常規雜交育種仍然是培育抗病品種的主要途徑。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的葡萄和病原菌特征基因組被揭示，更多的抗性基因被發掘和應用在遺傳育種中。一方面，挖掘NBS-LRR抗病基因通過轉基因或過表達基因顯著提高了植物的抗病性。目前，葡萄中少數NBS-LRR基因已被克隆，然而缺少深入研究。葡萄NBS-LRR蛋白不同結構域與病原菌的效應蛋白是如何相互作用的？在親和與非親和互作中NBS-LRR蛋白起作用的差異是什么？這些問題的解決對葡萄NBS-LRR基因的利用具有重要的意義。另一方面，小RNA在葡萄抗病中發揮重要作用，通過對小RNA的調控可以實現葡萄抗病性的提高，不同葡萄的病原真菌誘導的相同小RNA的表達不同，這可能與葡萄的遺傳、生長階段以及R基因的存在與否有關。因此，通過反向遺傳學方法對單個小RNA及其靶基因在抗病遺傳育種中的有效應用將成為今后研究的重點。最后，感病基因（S）突變能提高果樹抗病性而成為果樹遺傳育種的目標。S基因突變在培育廣譜而持久抗性品種中具有很好的應用前景。S基因是病原菌-寄主間親和互作的決定因子，在遺傳育種中具有巨大的應用價值，隨著基因組編輯技術和轉基因技術的發展，S基因應用的前景必將越來越廣闊。