Long non-coding RNA在前列腺癌中的研究

李祥春，王新慧，盧蕻迪，張 迎，劉子玲

(吉林大學第一醫院，吉林 長春130012)

LncRNA的本質是RNA，是由核苷酸組成的長鏈，有以下幾個優勢：(1)可以輕松與同源DNA/RNA序列結合；(2)可以折疊成復雜的二級結構，輕松與多種蛋白質結合。也就是說，LncRNA情商極高，與上層領導(DNA)關系曖昧，與同事(RNA)關系很鐵，與下屬(蛋白質)關系緊密。因此，LncRNA的表達模式在腫瘤進展過程中經常發生變化，它們的表達水平可能持續上升(如HOTAIR)，也可能穩步下降(DRAIC)。因此，LncRNA 在PCa中對腫瘤發生、發展所起到的作用,具有診斷功能、預后和預測功能。考慮到LncRNA在PCa中的動態作用，LncRNA不僅可以作為生物標志物，也可作為治療靶點，減緩去勢抵抗的發展，維持穩定的疾病，阻止轉移擴散。

1 激素敏感性前列腺癌

1.1 PCA3

PCA3是在PCa中發現的第一個LncRNA，95%PCa組織中表達明顯過高[1,2]。其位于PRUNE2的內反義區，在核PRUNE2/PCA3雙鏈RNA形成后，作用于RNA 的腺苷脫氨酶與dsRNA結合，促進腺苷對肌苷的編輯，隨后抑制復合物的翻譯。簡言之，PCA3基因的靶點之一是腫瘤抑制基因PRUNE2，PCA3和PRUNE2的表達與PCa負相關[3,4]。

研究發現，PCA3的功能并不局限于一個特定的過程。相反，它涉及多種機制，包括參與上皮-間充質轉換(EMT)以及AR輔助因子對PCA3基因的調控[5]。利用siRNA或shRNA敲除LNCaP細胞中的PCA3基因，可誘導上調AR輔助因子的多個轉錄本編碼，并調節EMT標記物的表達。LNCaP細胞通過攜帶shRNA序列的慢病毒載體進行轉導，PCA3表達穩定下調，導致表達該轉基因的LNCaP細胞比例顯著下降(60%)[6]。PCA3靶向shRNA序列轉導LNCaP細胞導致細胞活力喪失，支持PCA3敲除作為一種公認的抑制PCa生長的治療方法的建議。PCA3還調控重要的癌癥基因的表達，參與血管生成(VEGFA、IFNB1、COL18A1),細胞粘附(MTSS1、ITGβ1),信號轉導(ERBB2、PIK3R1、MAP2K1)和細胞凋亡(BCL2L4、TERT)[5]。

在去勢抵抗性前列腺癌(CRPC，Castration Resistant Prostate Cancer)中的研究發現，穩定的AR沉默表達可使血清PSA水平顯著下降，原發性PCa進展到CRPC明顯減緩[6]。因此，考慮到CRPC對抗雄激素治療方法具有抗性的幾個分子機制，提出穩定沉默PCA3的策略，以維持AR下調，這可能會提高CRPC患者的療效[7]。綜上，PCA3除了作為診斷生物標志物外，將來也可成為治療靶點，特別是對治療效果不佳的CRPC患者。

1.2 DANCR

DANCR是定位于染色體4q12的LncRNA，其長度約為850堿基。DANCR是表皮細胞去分化所必需的，其在PCa中經常過表達，并導致TIMP2/3的下調，這通常阻止腫瘤的侵襲和轉移擴散[8]。此外，DANCR似乎介導EZH2(催化H3K27甲基化的KMT6)表觀遺傳沉默子、增強子與TIMP2/3的結合，最有可能是作為支架LncRNA。這種觀察在體外也很明顯，表現在PCa細胞系中的DANCR表達高于永生化的前列腺上皮細胞系[9]。

在轉移方面，健康的前列腺中，雄激素-AR信號通路驅動上皮細胞的終末分化，減少DANCR水平，同時增強TIMP2/3的表達[10]。在前列腺癌中，功能性雄激素AR軸阻止惡性細胞的侵襲和轉移[11]。如上所述，ADT用于激素敏感性前列腺癌(HSPC，Hormone-sensitive Prostate Cancer)的治療，大多數Pca通過繞過下游通路激活所必需的雄激素-AR的相互作用而對常規ADT產生抗性。在這種情況下，使用恩雜魯胺既直接靶向AR，又抑制下游信號通路。矛盾的是，恩雜魯胺似乎能更有效地阻斷雄激素-AR軸，DANCR的表達不再受到抑制，導致TIMP2/3水平降低，并開始遷移、侵襲和轉移[12]。

綜上，DANCR通常抑制上皮細胞的分化，抵消雄激素-AR途徑在前列腺中的作用[13]，敲除DANCR可減少轉移癌和侵襲性PCa細胞的比例。因此，在用恩雜魯胺治療期間同時阻斷DANCR有可能抑制細胞遷移并防止轉移擴散[14]。目前已有數據支持DANCR作為潛在的生物標志物來預測預后以及早期轉移情況。但臨床上仍需要更多人體數據來闡明前列腺癌中DANCR的臨床相關性。

1.3 GAS5

GAS5是第一個發現在PCa細胞中起促進細胞死亡作用LncRNA[15]，GAS5的特殊結構成分-糖皮質激素響應素模擬(GREM)，作為一種誘引物，以序列特異性的方式與類固醇受體(SRs)進行交互，從而拮抗SRs介導的轉化和進一步抑制細胞生長[16]。在增殖細胞中，GAS5的翻譯受雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的機制靶點和無義介導的衰變(NMD)通路調控[17,18]。活躍的mTOR途徑促進GAS5短閱讀框的翻譯,隨著NMD降解這些GAS5轉錄物，GAS5水平降低[19]。

在PCa背景下，GAS5通過隔離復合物來促進癌細胞的死亡，并阻止雄激素-AR復合物與目標DNA的結合[20]。GAS5在mCRPC中下調，低水平的LncRNA與化療誘導的細胞凋亡減少有關[21]。mTOR抑制劑的使用導致雄激素依賴性和雄激素敏感性PCa細胞系中GAS5的增加。臨床實踐中，mTOR抑制劑可用于早期PCa，通過上調GAS5來增強細胞凋亡。而mTOR抑制劑在去勢抵抗性細胞中的無效性最可能與GAS低水平有關[22]。實驗表明，GAS5轉染22RV1和PC3細胞，細胞凋亡增加，存活率降低，可增強放療或化療對細胞的殺傷作用，這表明mTOR抑制劑需要GAS5用于PCa細胞的生長抑制，具有更高水平的內源性GAS5表達的PCa細胞系，例如LNCaP和22RV1，對mTOR抑制劑表現出更好的反應[23]。這意味著操縱GAS5表達有助于抑制PCa腫瘤生長并提高化療在PCa治療藥物療效。

GAS5 作為一種抑癌基因，其表達下調常與腫瘤的發生、發展、轉移及預后密切相關，其低表達提示腫瘤預后不良。除此之外,GAS5 的表達能增加腫瘤細胞對化療藥物如順鉑、阿霉素等的敏感性,提示GAS5 將成為治療新靶點。

1.4 UCA1

UCA1最初在膀胱移行癌中被發現，與增殖和凋亡有關。高水平的UCA1表達與PCa的不良預后有關，這意味著UCA1與高gleason評分、晚期TNM分期和較短的OS呈正相關[24]。有趣的是，其抑制作用可能具有治療意義，因為使用針對UCA1的RNA可抑制增殖并可增加體外凋亡細胞的比例。這種效應部分是通過KLF4- KRT6/KRT13途徑發生的，其中KLF4是一種轉錄因子，與分化和增殖相關，其在PCa組織中的表達也顯著高于相應的非腫瘤鄰近組織[25]。

另一方面，UCA1也被認為是輻射反應的重要介質之一。使用siRNA敲除策略，已經證明UCA1敲除可以提高PCa細胞株的放射敏感性和耐輻射性PCa細胞數量[25]。研究表明UCA1 和 miR-143 位于相同的RNA誘導沉默復合體(RISC)中，抑制 UCA1 的表達后直接降低 miR-143在前列腺癌中的表達活性，從而起到一定的腫瘤抑制作用[26]。UCA1既可作為一種分子標記物，對PCa放療及預測預后有重要價值，也為PCa的診治提供了新的參考方向。

2 去勢抵抗性前列腺癌

2.1 PCGEM1

PCGEM1在超過一半PCa組織中過表達，研究發現，其表達與腫瘤惡性程度顯著相關，包括分化程度、臨床分期、轉移等[27]。PCa細胞可以通過ADR剪接變異體，最終導致激素抵抗。七個AR剪接變異體是已知的，AR-V7具有最高的臨床相關性[28]。PCGEM1在PCa組織中高達80%，并在抑制細胞凋亡的同時增強增殖[28]。ADT導致PCGEM1上調，隨后重新定位到細胞核，PCGEM1與核糖核酸小體輔助因子2(U2AF65)和核不均一核糖核蛋白(hnRNP)的相互作用增強[29]。PCGEM1與hnRNP A1的結合，是AR-V7的負調控因子，降低了HNRNP A1與AR前mRNA的親和性，并且抑制U2AF65與相同的前mRNA結合的能力[29]。因此，PCGEM1在雄激素剝奪狀態下的上調導致AR-V7的表達，從而促進治療抵抗和mCRPC的發展。

在臨床實踐中，不僅可用于預測惡性程度，在ADT上同時阻斷PCGEM1也可提高治療藥物的療效，這為發現新的腫瘤生物標志物及分子治療靶點提供了新的理論依據。

2.2 HOTAIR

HOTAIR 通常受到AR的抑制，與早期PCa相比，HOTAIR在mCRPC中的表達明顯過量[30]。通過與AR蛋白的N端域(NTD)結合，HOTAIR阻止了小鼠MDM2與NTD的相互作用。因此，可以防止AR的泛素化和降解[30]。此外，HOTAIR以一種與雄激素無關的方式誘導并維持AR的激活。

HOTAIR的過表達增強了去勢抵抗細胞的增殖和侵襲能力。此外，在用恩雜魯胺治療后，LADaP細胞系中HOTAIR水平不斷增高[30]。這可以部分解釋恩雜魯胺治療期間耐藥性發展的機理。在臨床實踐中，HOTAIR可作為抗恩雜魯胺耐藥的生物標志物。此外，同時靶向HOTAIR可能增強新型抗雄激素如恩雜魯胺所發揮的抗增殖作用[30]。

2.3 MALAT-1

MALAT1(轉移相關的肺腺癌轉錄因子-1)，顧名思義，首先被確定為支氣管肺癌的預后因素。最近的研究表明，MALAT-1可能是一種很有前途的PCa診斷和檢測的生物標志物[31]。在前列腺中，MALAT-1的表達水平在從HSPC到CRPC進展過程中顯著增加[31]。MALAT-1與EZH2結合，這是PRC2復合物(Polycomb Repressive Complex 2)的核心亞基，在前列腺癌中也經常過度表達[32]。

在PCa中，DAB2互作蛋白(DAB2IP)通過增強EMT誘導劑β-catenin的降解而抑制EMT[32]。此外，MALAT-1與EZH2的相互作用也調節基因的多梳獨立表達，包括跨膜蛋白48(TMEM48)和 細胞周期蛋白依賴性激酶調節亞基2(CKS2)。MALAT-1促進去勢抵抗性細胞的遷移和侵襲，并導致DAB2IP的解除抑制[32]。對434例中國男性尿液標本的調查顯示，MALAT-1對PSA水平在4-10 ng/ml之間的男性有利于前列腺癌診斷，MALAT-1評分比目前推薦的%fPSA更具有診斷準確性[31]。臨床上，MALAT-1與晚期腫瘤分期、PSA水平升高和ADT抵抗有關[32]。此外，它可以作為輔助診斷PCa的非侵入性生物標志物，尿MALAT-1水平比常規PSA篩查更準確地預測PCa風險，并且可能減少1/3不必要的前列腺活檢[32]。

2.4 NEAT1

在mCRPC中，通過雌激素受體α(ERα)發出的信號是繞過雄激素-AR軸的有效機制[33]，是調節腫瘤發生的重要步驟，如TMPRSS2-ERG融合基因的表達，這在ETS陽性PCa類型中經常發現[34]。此外，ERα誘導PCNA中NEAT1的轉錄[33]，而NEAT1無論體內還是體外均可促進細胞增殖和侵襲[33]。

值得注意的是，NEAT1水平隨著他莫昔芬、比卡魯胺或恩雜魯胺使用而增加[33]。因此，ERα和NEAT1水平在mCRPC中顯著高于原發性PCa，這表明ERα-NEAT1相互作用在促進去勢抵抗中可能發揮作用。在PCa，升高的NEAT1水平與早期生化復發和轉移擴散相關[33]。因此，NEAT1不僅構成PCa治療的潛在靶點，而且可以作為早期生化復發的預后生物標志物。

為了改善PCa患者的管理，需要新的診斷、預測和預后生物標志物。理想的生物標志物應該能夠檢測出一種疾病的存在并預測它的進展，即，識別高危個體、預測復發、監測治療反應。PCa，尤其是CRPC，是一種異質性疾病，我們不期望在疾病的所有階段都能找到一個單一的生物標志物，因此需要多個生物標志物來解決每個特定的臨床問題。隨著PCa發病的分子機制逐漸被發現，新型抗雄激素引入臨床實踐，顯著提高了對常規抗激素治療抵抗患者的預期壽命。LncRNAs參與各個階段的腫瘤進展，它們可以在雄激素缺乏的情況下保留與雄激素相關的通路，促進激素抵抗狀態的進展，或者保持細胞的增殖和入侵，不受雄激素的影響。LncRNA作為治療靶點，同樣可以增強抗腫瘤藥物的療效，幫助減緩PCa的進展。

雖然已經有幾個前列腺腫瘤的轉錄譜，但在大多數病例中測序深度仍然太低，低表達LncRNA的檢測也受到影響。因此，對于LncRNA的研究來說，有必要建立一個更直接的概要文件，以便對改變的LncRNA進行完整的概述。此外，該技術對單個患者的轉錄組序列進行組裝的高成本是一個重要的限制。因此，LncRNAs作為生物標志物的未來應用仍停留在更精確的技術上，如定向測序面板、特定微陣列、特定LncRNA的RT-qPCR分析以及原位雜交。最后，將LncRNAs引入臨床實踐作為PCa診斷、預測和預后具有必要性，因為LncRNAs有超強優勢，其在體液中具有高穩定性，包括血液、尿液或唾液和前列腺液，使它們在易于獲取并易于檢測。