家畜布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查

李尤龍 楊艷明 李登峰

（1，云南省曲靖市羅平縣大水井鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心 655800；2，云南省曲靖市羅平縣畜禽改良工作站 655800；3，云南省曲靖市羅平縣動物疫病預(yù)防控制中心 655800）

布魯氏菌病（簡稱布病）是由布魯氏菌屬細菌感染導(dǎo)致人畜共患的常見傳染病，在全世界范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康，影響畜牧業(yè)發(fā)展。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告的傳染病，我國規(guī)定布病為多種動物共患的二類動物疫病。因此，開展家畜布病的血清學(xué)調(diào)查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本來源、采樣要求和采樣比例

對去年監(jiān)測出陽性畜的場（戶）100%采樣監(jiān)測，對引入飼養(yǎng)期限不足半年的牲畜實行100%采樣監(jiān)測，對養(yǎng)牛20頭以上、羊20只以上、豬50頭以上的規(guī)模場戶按5%比例采集血清（種公畜、母畜、育肥畜比例為1∶3∶1），對監(jiān)測有陽性畜的養(yǎng)殖場（戶、企業(yè)）實行100%采樣復(fù)檢。羊共調(diào)查13個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）105個行政村280個自然村，10個規(guī)模場、570戶散養(yǎng)戶，調(diào)查羊35634只，共采集羊血清2188份；豬共調(diào)查13個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）48個行政村73個自然村，31個規(guī)模場，66戶散養(yǎng)戶，調(diào)查豬21318頭，共采集豬血清751份，牛共調(diào)查13個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）16個行政村20個自然村，3個規(guī)模場、17戶散養(yǎng)戶，調(diào)查牛11856頭，共采集牛血清150份。

1.2 檢測試劑及儀器

布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原（批號：20180701），布病陽性標(biāo)準(zhǔn)血清、布病陰性標(biāo)準(zhǔn)血清，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)；布氏菌競爭ELISA抗體檢測試劑盒（批號：20180316），由青島立見診斷技術(shù)中心生產(chǎn)，于2～8℃冷藏保存?zhèn)溆谩崈舻囊淮涡苑磻?yīng)板，其上已有劃好的4cm2圓圈，單道微量移液器、多道微量移液器、吸頭，純水儀、酶標(biāo)儀、二級生物安全柜，恒溫培養(yǎng)箱等。

2 檢測方法與結(jié)果判定

2.1 虎紅平板凝集試驗和結(jié)果判定

試驗前將待檢血清、陰性血清、陽性血清和抗原恢復(fù)至室溫（20～25℃）。在一次性反應(yīng)板上標(biāo)記好被檢血清號，在其上滴加虎紅平板凝集試驗抗原30ul，然后在抗原旁滴加被檢血清30ul，用吸頭攪動血清和抗原，使之充分混合，每加一個被檢血清都要換吸頭，在4min內(nèi)觀察結(jié)果，設(shè)陰性血清、陽性血清對照。在陰、陽性血清對照成立的條件下方可對被檢血清進行判定。受檢血清在4min內(nèi)肉眼可見不同成度顆粒狀或絮狀凝集現(xiàn)象者判為陽性(+)，無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性(-)。出現(xiàn)陽性的再用競爭酶聯(lián)免疫吸附（cELISA）試驗進一步檢測確診。

2.2 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗和結(jié)果判定

根據(jù)試劑盒說明書進行試驗操作和結(jié)果判定。試驗準(zhǔn)備，試劑盒各組分在使用前均恢復(fù)至室溫（20～25℃），加液前充分搖勻，將洗滌液20倍稀釋。操作步驟，BRUC抗原包被板每孔加入稀釋好的洗滌液40ul，A1、B1孔加入10ul BRU陰性血清，C1、D1孔加入10ul BRU陽性血清，剩余孔各加入10ul樣品血清，每孔加入50ul競爭抗體，輕輕振勻，37℃孵育60min。甩干BRUC抗原包被板中的液體，每孔加入300ul洗滌液，洗滌3次，每孔加入100ul酶標(biāo)抗體，輕輕振勻，37℃孵育30min，甩干BRUC抗原包被板中的液體，每孔加入300ul洗滌液，洗滌3次，每孔加入50ul底物溶液A，再加入50ul底物溶液B，37℃孵育15min，每孔加入50ul終止液終止顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的OD值。結(jié)果判定，BRU陰性血清的平均OD值應(yīng)大于0.5，BRU陽性血清的OD值應(yīng)大于60%，試驗結(jié)果有效，否則重新試驗；樣品抑制率≥50%判為陽性，樣品抑制率＜50%判為陰性[1]。

3 結(jié)果

通過虎紅平板凝集試驗共集中檢測樣品3089份，其中豬血清751份、牛血清150份、羊血清2188份，2份羊血清為陽性，其余樣品為陰性；2份羊血清陽性樣品和180份牛羊血清陰性樣品通過競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測，結(jié)果全為陰性。通過篩選和確診試驗3089份血清樣品全部判定為陰性。

4 小結(jié)

（1）加強家畜布病的血清學(xué)學(xué)調(diào)查。每年進行兩次集中采樣和布病血清學(xué)監(jiān)測，應(yīng)用虎紅平板凝集試驗(RBT)進行初篩，然后進行競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗確診。

（2）一些養(yǎng)殖戶對家畜布病防控工作的重要性認知不足。監(jiān)測出陽性畜的場（戶）進行復(fù)檢，采集血清時，因不滿足撲殺補助標(biāo)準(zhǔn)阻止采樣，難做工作，需要加強宣傳力度。

（3）流行病學(xué)調(diào)查面廣，工作量大，需加大人力、物力、財力的投入。

（4）獸醫(yī)實驗室正常運行需要大量經(jīng)費支持，實驗室工作經(jīng)費緊缺，儀器設(shè)備、試劑耗材滿足不了監(jiān)測工作的需求。監(jiān)測動物的種類、范圍、數(shù)量等會受到限制，需加大實驗室經(jīng)費投入[2]。