化療所致造血干細胞衰老的相關信號通路及中藥治療進展

王玨，陳朝輝

(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310053；2.象山縣第一人民醫(yī)院，浙江 象山 315700)

隨著發(fā)病率和死亡率的不斷提高，癌癥已成為我國主要的死亡原因，也是重大的公共衛(wèi)生問題。發(fā)布的文獻顯示[1]，2015年我國新發(fā)腫瘤病例429.2萬，致死病例281.4萬。雖然癌前檢查的技術不斷得到提升，但是大多數腫瘤患者在疾病被診斷時已處于中晚期，化療是腫瘤治療手段中必不可少的，化療的療效確切，但在殺傷腫瘤細胞同時，往往也對正常的細胞造成損害，尤其是對骨髓造血功能的抑制，有研究表明[2]90%以上的化療藥物都會引起骨髓抑制。目前認為化療導致骨髓抑制最關鍵的機制[3]是造血干細胞衰老。

造血干細胞衰老的機制目前仍不明確。現(xiàn)有研究[4]表明其機制包括DNA損傷、端粒縮短、活性氧(ROS)水平升高、表觀遺傳修飾、細胞極性改變、代謝及造血微環(huán)境等幾方面，涉及到多條信號通路。多數研究[5-6]認為不同的DNA損傷因素最終均會通過p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路抑制正常細胞周期的進行，使細胞周期阻滯于G1期，最終導致細胞衰老。p53-p21通路也能間接的被端粒縮短所激活，進而引起造血干細胞衰老[7]。ROS水平升高可以直接或者間接的激活p38-MApK、p53-p21、p16-Rb通路導致造血系統(tǒng)應激能力下降而造成造血干細胞衰老[8]。

化療后骨髓抑制屬于中醫(yī)“虛勞”范疇，其病機主要表現(xiàn)為脾腎兩虛。多種中藥復方及中藥單體被證明，在防治骨髓抑制，抑制造血干細胞衰老上有著良好的作用及優(yōu)勢。現(xiàn)將造血干細胞衰老的相關信號通路，及中醫(yī)藥干預的研究做一綜述。

1 造血干細胞衰老相關信號通路

1.1 p53-p21Waf1/Cip1通路

研究顯示，化療造成DNA損傷后，會招募和激活ATR和ATM兩種蛋白激酶聚集于DNA損傷部位，ATR和ATM分別感應不同形式的 DNA 損傷，可以使損傷部位的H2A組蛋白變異體(H2AX)磷酸化進而觸發(fā)DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)[9]以及周期檢測點激酶CHK2和CHK1的磷酸化，再通過下游級聯(lián)激活反應將DDR信號擴散，從而誘導p53的激活[10]，p53能夠直接誘導周期蛋白依賴型激酶抑制劑p21的表達，從而下調CDK2，最終將細胞周期阻斷在G1期，從而抑制細胞自我更新能力，造成造血干細胞衰老[11]。

1.2 p16 Ink4a-Rb通路

研究表明，當體內ROS水平升高到一定水平后能夠激活p38/MApK通路[12]，進而激活另一周期蛋白依賴型激酶抑制劑p16Ink4a的表達，p16Ink4a作為CDK的主要抑制劑，可以抑制CDK4/6激活從而降低Rb的磷酸化而減少E2F基因的表達，導致細胞阻滯于G1期并且形成細胞衰老相關的異染色質位點[13]，使衰老進入不可逆階段。

1.3 SIRT6 /NF-κB信號通路

SIRT6是調節(jié)細胞衰老的關鍵基因，乙酰化酶SIRT6的功能缺陷可影響DNA的修復，而導致衰老。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，SIRT6能夠促進NF-κB靶基因啟動子H3K9的脫乙酰作用，從而抑制NF-κB信號通路調控的端粒非依賴性干細胞衰老。

1.4 Wnt/β-catenin信號通路

研究表明[15]Wnt/β-catenin信號通路可以調節(jié)造血微環(huán)境而引起造血干細胞衰老。當胞外不存在Wnt信號通路抑制物時，Wnt與細胞膜上Frizzled和LRp/56受體結合，抑制了GSK-3β活性，從而減弱其對β-catenin的磷酸化作用，引起β-catenin的聚集，進而向細胞核內移位，與FOXO轉錄因子結合，抑制β-catenin下游TCF/LEF的轉錄，引起造血干細胞衰老。

1.5 PI3K/AKT /mTOR信號通路

當外界信號激活磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide 3 kinases,PI3K)時，PI3K會將質膜上3、4-二磷酸磷脂酰肌醇(PI-4,5-P2, PIp2)磷酸化為3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PI-3,4,5-P3,PIp3)[16]，活化的PIp3會募集胞質內的絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)，通過與AKT N端的pH結構域結合協(xié)同激酶PDK1磷酸化AKT的絲氨酸磷酸化位點(Ser473)和蘇氨酸磷酸化位點(Thr308)[17]，激活AKT，活化的AKT可以直接磷酸化mTOR使其激活，從而促進HSC的生長和存活等過程。

PI3K及其效應物AKT是維持HSC穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)因子，部分PI3K的缺失會導致HSC再填充潛力的降低[18]。AKT和mTOR的過度激活會使HSC擴增，大量進入細胞周期，發(fā)生HSC的耗竭，這對于骨髓抑制的病人來說是一個惡性循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn),當同時敲除AKT1和AKT2時，會導致HSC滯留在G0期，無法向下分化。

1.6 Notch信號通路

Notch信號通路可以不通過第二信使，直接對下游HES、HEY，以及E47等核轉錄因子進行調節(jié)，對細胞的增殖分化具有重要影響作用。哺乳動物中存在Notch1-4四種Notch受體蛋白，以及Jagged-1,Jagged-2,Delta-like-1,3,4五種Notch配體蛋白，均為跨膜蛋白。Notch受體蛋白經三次酶切后跨膜進入細胞核，繼而通過DNA結合蛋白CSL依賴或非依賴途徑，促進轉錄因子HES和HEY、或抑制轉錄因子E47的功能，促進下游基因的表達，實現(xiàn)對細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和黏附等的影響[19]。

1.7 TGF-β信號通路

TGF-β被認為是HSC體外生長的最有效抑制劑之一。在穩(wěn)態(tài)環(huán)境中，HSC處于休眠狀態(tài)，而休眠狀態(tài)對于維持HSC功能及數量起著非常重要的作用，TGF-β被發(fā)現(xiàn)是HSC休眠的主要調節(jié)因子。TGF-β信號通路的激活與Smad蛋白有著密切的關系。受體激活型R-Smads可直接被TGF-β磷酸化激活，然后與通用型Co-Smads結合，形成異源二聚體，進一步導致活性聚合體的核內累積，發(fā)揮針對靶基因的轉錄調控作用；而另有一種Smad蛋白—抑制型I-Smads，其發(fā)揮的作用剛好和受體激活型相反，I-Smads通過抑制TGF-β信號的傳導，阻斷R-Smads和Co-Smads的相互作用來負反饋調節(jié)TGF-β。Smad蛋白的磷酸化可以進一步上調細胞周期素依賴性激酶抑制劑如p15Ink4b、 p21Cip1和p27Kip1，從而干預造血干細胞的生長抑制[20]。

2 中藥干預造血干細胞衰老

2.1 當歸多糖對造血干細胞衰老的影響

中藥當歸有補血活血作用，被譽為“補血之圣藥”“活血行氣之要藥”。《本草正》認為當歸“誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也。”“凡有形虛損之病，無所不宜”。當歸多糖是當歸的主要成分，能夠促進造血。張先平等[21-22]發(fā)現(xiàn)當歸多糖能顯著改善衰老造血干細胞G1期阻滯及SA-β-gal(β-半乳糖苷酶)陽性率的增加；增加端粒長度和端粒酶活性；下調p53、p21、p16的表達，上調CDK4/6、CyclinD及CyclinE的表達，進而減少細胞衰老。但研究發(fā)現(xiàn)當歸多糖對CDK2的表達未見明顯影響，因此當歸多糖緩解造血干細胞衰老的機制可能與抑制p16-Rb信號通路過度激活有關。張巖巖等[23]發(fā)現(xiàn)，當歸多糖能顯著降低衰老造血干細胞的SA-β-gal 染色陽性率和ROS水平；通過下調β-catenin、phospho-GSK-3β和TCF-4蛋白表達，上調GSK-3β 蛋白表達，而這些蛋白都是Wnt/β-catenin 信號通路上的機制分子，故其研究認為當歸多糖延緩造血干細胞的機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號通路過度激活有關。

2.2 黨參多糖對造血干細胞衰老的影響

黨參味甘，性平。有補中益氣、止渴、健脾益肺，養(yǎng)血生津的作用。黨參多糖是從黨參中提取的有效成分，近年來的研究發(fā)現(xiàn)黨參多糖在調節(jié)免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗應激、抗氧化等很多方面具有較好的生物活性。王慧云[24]發(fā)現(xiàn)黨參多糖可以清除衰老血管內皮細胞內的自由基，降低細胞內的ROS水平；進一步的檢測發(fā)現(xiàn)黨參多糖可以影響衰老的EA.hy926細胞的甲基化程度及表觀遺傳相關蛋白及基因表達，使EZH2、Bmi-1、DNMT1 mRNA的表達含量升高，JMJD3 mRNA的表達量下降，減弱氧化作用下所導致的應激衰老進程，從而緩解血管內皮細胞的衰老。許朋等[25]發(fā)現(xiàn)黨參多糖可以明顯提升血清中C3、C4、IgG、IgM、IgA、GH、IGF-1、T3、T4、INS的生成水平，對環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下大鼠具有明顯的增強作用。進一步的研究顯示，黨參多糖不僅可以降低體內的ROS水平，改善氧化損傷，改善免疫功能低下，還能干預衰老相關的信號通路。李義波等[26]發(fā)現(xiàn)黨參多糖干預后，β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率明顯降低，造血干細胞G1期阻滯明顯降低，并且p53、p21、Bax蛋白表達下調、Bcl-2蛋白表達上調。因此，實驗證明黨參多糖能夠干預p53-p21信號通路從而延緩造血干細胞的衰老，同時也可以調控Bcl-2蛋白干預造血干細胞的凋亡。

2.3 人參皂苷對造血干細胞衰老的影響

人參自古譽為“百草之王”，味甘、微苦，性溫、平。歸脾、肺經、心經。補氣，固脫，生津，安神，益智。人參皂苷被認為是人參中的主要活動成分，包括RH2、Rg1、Rg2、Rg3等，其主要作用表現(xiàn)為抗腫瘤、增強機體抗氧化及抗衰老能力、提升機體免疫能力等方面，臨床上的研究多以人參皂苷Rg1為主要研究對象。周玥、李淵等[27-30]的多項研究發(fā)現(xiàn)，相較于衰老模型組，人參皂苷Rg1干預后，Sca-1+HSC/HPC G0/G1期細胞比例、SA-β-Gal染色陽性率明顯下降，CFU-Mix數量明顯升高；SIRT6 mRNA及蛋白表達上調，NF-κB mRNA及蛋白表達下調，證實了人參皂苷Rg1可能通過調控SIRT1/NF-κB信號軸抵抗造血干細胞的衰老。夏婕妤[31]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1干預后，Sca-1+HSC/HPCs增殖能力增強；形成CFU-Mix數量增加；SA-β-Gal染色陽性細胞百分率減少；細胞質及細胞核內β-catenin蛋白表達下調,GSK-3β蛋白表達量上降，TCF-4蛋白及β-catenin、C-myc、CyclinD1 mRNA表達下調；Sca-1+HSC/HPCs內ROS水平，γ-H2AX水平；血清中8-OH-dG含量下降；p53及p21蛋白及mRNA表達下調，說明人參皂苷Rg1可能通過p53/p21通路、細胞DNA氧化損傷、氧化應激等機制調控Wnt/β-catenin信號通路進而延緩Sca-1+HSC/HPCs衰老。Zeng YC等[32]的研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1不僅能夠改善衰老大鼠體內的氧化損傷，還能明顯降低p16、p21、p53的表達水平，進一步降低其下游細胞周期蛋白CDK2和CDK4的表達，從p53-p21和p16-Rb通路緩解造血干細胞的衰老。

2.4 中藥復方對造血干細胞衰老的影響

脾胃為氣血生化之源，脾胃受損，脾失健運，則氣血生化乏源; “腎藏精，精者，血之所成也。”腎精虧損，則血之源頭窮竭[33]。故臨床上治療化療后的造血干細胞衰老，多采用健脾補腎的方劑。張陽陽[34]發(fā)現(xiàn)補腎化瘀生新方可通過下調衰老關鍵基因p16INK4a、p53、p21的表達來延緩BMSCs的衰老，說明補腎化瘀生新方調控BMSCs的衰老與其抑制p16-pRb和p53-p21途徑密切相關。相對于中藥單體來說，中藥復方成分更加復雜，其發(fā)揮作用的成分也更加多樣，并且不同的配伍會導致中藥效果存在差異。孔琳林等[35]發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖可以誘導形成亞急性衰老大鼠，其體內的總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫酶(CAT)水平及抑制超氧陰離子自由基能力下降，過氧化氫(H2O2)含量升高，p16蛋白表達水平上調，左歸丸對上述癥狀有逆轉作用，說明p16通路可能是左歸丸調控細胞衰老的機制之一。然而與左歸丸相比，六味地黃丸未能明顯降低大鼠體內H2O2含量，推測可能是因為左歸丸中配伍的補陽藥鹿角膠具有更加強力的抗氧化能力。

2.5 針灸對造血干細胞衰老的影響

針灸是中醫(yī)針法和灸法的總稱，是在中醫(yī)理論指導下把針具(通常指毫針)按照一定的角度刺入患者體內，運用捻轉與提插等針刺手法來對人體特定部位進行刺激從而達到治療疾病的目的。針灸是中國特有的一種“內病外治”的治療手段，針灸在臨床上具有操作簡便，療效顯著，成本低廉等優(yōu)點。針對化療后造成的骨髓抑制，研究發(fā)現(xiàn)[36]針灸環(huán)磷酰胺作用后的骨髓抑制小鼠，可以抑制Notch信號通路的過度激活，上調Notch信號通路相關差異基因numb1、numb2的表達，增強骨髓造血功能。因此，抑制Notch信號通路可能是針灸減輕CTX化療引起的骨髓抑制、改善造血功能的分子機制之一。雖然有報道[37]稱針灸可以改善阿爾茨海默病小鼠海馬神經干細胞治療后的腦微環(huán)境，然而，至今未見更多關于針灸干預造血干細胞衰老相關信號通路的研究。

3 小結

目前，針對化療后造血干細胞衰老的信號通路研究，最集中最經典的還是p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路。中醫(yī)藥在延緩造血干細胞的作用中存在著多靶點的優(yōu)勢，如人參皂苷Rg1和當歸多糖都能通過p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路來調節(jié)造血干細胞的衰老，中藥通過另外的通路緩解細胞衰老的研究也有建樹。本課題組也在進行基于p16Ink4a-Rb信號通路探討龜鹿二仙膠抗化療誘導的骨髓造血干細胞衰老的分子機制研究[38]。但目前對于中醫(yī)藥延緩造血干細胞衰老的調控基因的認識仍不足，希望能進一步深入研究。