蜂產(chǎn)品抗生素殘留檢測的研究進(jìn)展

林春瑤，劉功良，白衛(wèi)東，趙曉娟，楊進(jìn)輝，賴秋萍

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.廣州市蜂嘜蜂業(yè)有限公司，廣東廣州 510900；3.廣東桂嶺蜂業(yè)科技股份有限公司，廣東梅州 514199）

蜂產(chǎn)品不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且還具有獨(dú)特的生理和藥理功能，因而在食品、醫(yī)藥業(yè)、化妝品行業(yè)、輕工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)等行業(yè)中的應(yīng)用日益增多，越來越受到人們的關(guān)注。2009年我國蜂產(chǎn)品（含制品）的銷售額已達(dá)到150億元，蜂蜜、蜂蠟的出口量均居世界第1位[1-2]。然而，我國蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的問題尚未得到有效解決，雖然這幾年通過無公害蜂產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的制定和實(shí)施，蜂產(chǎn)品中氯霉素超標(biāo)問題在出口產(chǎn)品中得到有效控制，但四環(huán)素、鏈霉素、林可霉素、氟甲砜霉素等抗生素的殘留現(xiàn)象仍然存在[3]。食用含有抗生素殘留超標(biāo)的蜂產(chǎn)品后，會直接影響人們的身體健康，其危害主要有以下幾個方面：過敏性反應(yīng)、細(xì)菌耐藥性、環(huán)境平衡紊亂或菌群失調(diào)、致畸、致突變等。我國在加入世貿(mào)組織后，由于蜂產(chǎn)品中抗生素殘留超標(biāo)而導(dǎo)致被外商拒收，這不僅給我國蜂業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重影響了我國蜂產(chǎn)品在國際市場上的聲譽(yù)[4]。介紹了蜂產(chǎn)品中抗生素殘留現(xiàn)狀及危害，蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的檢測方法，以期為蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的快速檢測及監(jiān)控提供依據(jù)。

1 抗生素殘留的原因及危害

抗生素是指生物在生命活動過程中產(chǎn)生的（或從化學(xué)、生物或生化方法中所產(chǎn)生的），并在低微濃度下能選擇性地抑制其他微生物的化學(xué)物質(zhì)。據(jù)相關(guān)研究表明，在養(yǎng)蜂的整個生產(chǎn)過程中，蜜蜂會得很多的病癥，其中腐臭病和敗血病是常見的病癥，當(dāng)蜜蜂得這些病的時候，就會大大降低蜂蜜的產(chǎn)量，從而影響出口量。所以，養(yǎng)蜂人士為了不讓其生病，會加入非常多的抗生素。現(xiàn)今，一些有花苞的農(nóng)作物被過多噴灑了農(nóng)藥，經(jīng)過蜜蜂代謝作用，部分蜂產(chǎn)品中殘留著抗生素。蜂產(chǎn)品中的藥物殘留、有害化學(xué)物質(zhì)污染和生物性污染是影響蜂產(chǎn)品安全的主要因素。

2 抗生素殘留檢測技術(shù)

2.1 微生物學(xué)測定法

微生物學(xué)測定法是目前廣泛應(yīng)用的測定抗生素方法，該方法可以直觀地反映抗生素藥品的抗菌活性并具有臨床特征。同時，微生物法所需儀器設(shè)備簡單、成本較低。目前，比濁法和瓊脂擴(kuò)散法被列為抗生素微生物檢定方法，被我國藥典中引用為標(biāo)準(zhǔn)方法，主要有紙片法、管碟法和氯化三苯基四氮唑法。

2.1.1 紙片法

根據(jù)抗生素能抑制微生物生長繁殖的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)。如果蜂產(chǎn)品存在抗生素殘留，則其樣品提取液可以抑制微生物生長；反之微生物的生長則不會受到抑制，而蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的多少則可以根據(jù)對微生物的抑制程度來判斷。王春奕等人[5]用圓盤法對西寧市消毒鮮牛奶中抗生素殘留的調(diào)查結(jié)果表明，檢測5批25份市售消毒鮮牛奶中抗生素殘留的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5×10-9以上。

2.1.2 管碟法

根據(jù)對抗生素敏感的試驗(yàn)菌在適當(dāng)條件下所產(chǎn)生的抑菌圈大小和藥物濃度成比例的關(guān)系設(shè)計(jì)而成[6]。朱麗云等人[7]采用微生物管碟法與高效液相色譜法2種方法對蜂蜜中四環(huán)素族抗生素的進(jìn)行檢測，分析兩者不同的準(zhǔn)確度、精確度和靈敏度，結(jié)果得到微生物管碟法檢測蜂蜜中四環(huán)素、土霉素、金霉素線性相關(guān)系數(shù)分別為0.994 2，0.992 2，0.991 6；回收率分別為80%，81%，78%。高效液相色譜法檢測蜂蜜中四環(huán)素、土霉素、金霉素線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9，0.999 7，0.999 7；回收率分別為80%，87%，83%。微生物管碟法操作周期長、操作繁瑣、誤差較大，但是靈敏度高；高效液相色譜法操作簡單、測量準(zhǔn)確，但是檢測金霉素靈敏度沒有微生物管碟法的高。

2.1.3 氯化三苯基四氮唑法

根據(jù)抗生素對微生物新陳代謝影響大而設(shè)計(jì)的。該方法以嗜熱鏈球菌為指示菌，氯化三苯基四氮唑?yàn)橹甘緞═TC的氧化態(tài)無色，還原態(tài)為無色），如果蜂產(chǎn)品中沒有抗生素存在，則其樣品提取液不影響指示菌的新陳代謝，從而能夠使無色氧化態(tài)的TTC還原為紅色還原態(tài)的TTC，培養(yǎng)液從無色變?yōu)榧t色。反之，提取液抑制指示菌的新陳代謝，抑制的程度和抗生素殘留量成正比，所以可依據(jù)培養(yǎng)液顏色有無變化及顏色變化的深淺來判斷樣品中抗生素的含量，微生物抑制法通常使用蠟狀芽孢桿菌，就檢測結(jié)果而言，其對四環(huán)素類抗生素非常敏感，其中二甲胺四環(huán)素的檢測限可達(dá)到0.001～0.002 mg/L，四環(huán)素和土霉素可達(dá)到0.025 mg/L，金霉素可達(dá)到0.005 mg/L。王婧[8]以發(fā)光菌青海弧菌和費(fèi)氏弧菌為待測菌種，通過固體培養(yǎng)在25℃恒溫水浴下與待測抗生素反應(yīng)，分別對磷霉素、甲磺酸左氧氟沙星和土霉素的毒性作用進(jìn)行檢驗(yàn)。研究表明，磷霉素對青海弧菌的抑制率較好，但作用時間短促，量效關(guān)系不夠理想；甲磺酸左氧氟沙星對費(fèi)氏弧菌的毒性作用量效果良好，但抑制率浮動較大；土霉素對這2種發(fā)光菌的毒性作用量效果關(guān)系均較好，對青海弧菌在前20 min低濃度下有毒性興奮作用，在作用50 min時，量效關(guān)系相關(guān)性最好；土霉素對費(fèi)氏弧菌的毒性抑制作用隨土霉素濃度變化呈直線關(guān)系，且這種關(guān)系比較穩(wěn)定。牛奶中測定時，土霉素對2種菌種的抑制效應(yīng)有著非常相似的規(guī)律，其抑制率隨時間的變化都比較穩(wěn)定，而且費(fèi)氏弧菌的量效關(guān)系更為穩(wěn)定。因此，費(fèi)氏弧菌更適合用于檢測牛奶中的土霉素。

2.2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是近年來逐漸應(yīng)用于檢測抗生素殘留的方法，其基本原理是通過特定酶對目標(biāo)物進(jìn)行標(biāo)記，底物經(jīng)過酶催化反應(yīng)后則顯色，最后通過酶標(biāo)儀測定，該過程較示蹤法而言，可以避免放射性物質(zhì)的污染，以及被標(biāo)記物衰變過快導(dǎo)致的檢測結(jié)果不夠準(zhǔn)確。同時，酶催化反應(yīng)的專一性很高，反應(yīng)效率也很高，即催化大量底物只需要短時間內(nèi)經(jīng)過微量的酶對其進(jìn)行催化，因此該方法具有較高靈敏度[9-10]。

邢淑婕[11]采用酶聯(lián)免疫法檢測蜂產(chǎn)品中土霉素的殘留，采用多克隆抗體作為相應(yīng)試劑盒，蜂蜜中土霉素的檢測范圍為5～200 μg/kg，相關(guān)系數(shù)為0.995 1，在此范圍內(nèi)對人工污染樣品的平均回收率為97.5%～107.5%；蜂花粉中土霉素的檢測范圍為50～200 ng/mL，在此范圍內(nèi)對人工污染樣品的平均回收率為92.61%～104.36%。

國占寶等人[12]利用自制的抗四環(huán)素單克隆抗體，研制了酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒用以檢測蜂蜜中四環(huán)素類抗生素的含量，靈敏度為0.05 ng/mL，檢測限為3～5 ng/mL，加標(biāo)回收率為90%±10%，平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%。

目前，食品分析越來越趨向于簡單、快捷、靈敏和微量化。與其他方法相比較，酶聯(lián)免疫吸附分析法具有高特異性和靈敏性優(yōu)點(diǎn)。其檢測范圍在納克（ng）和皮克（pg）之間，屬于超微量分析技術(shù)；該方法結(jié)果精確、重現(xiàn)性好、成本低、操作簡單、樣品處理量大[13]。但酶聯(lián)免疫吸附分析法不可避免地存在一些缺陷，對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分；對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)；分析分子量小的化合物或不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。因此，許多學(xué)者致力于改進(jìn)和完善該技術(shù)，重點(diǎn)研究多克隆抗體轉(zhuǎn)向單克隆抗體，純化抗體和抗原，改進(jìn)抗體的載體、反應(yīng)環(huán)境和定量方式等方面[14]。

2.3 液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)

高效液相色譜（HPLC）技術(shù)是一種分離效率高、分析速度快的方法。近年來，在抗生素殘留檢測中廣泛應(yīng)用，是一項(xiàng)較為成熟的技術(shù)。

吳華等人[15]采用高效液相色譜法檢測蜂蜜中氯霉素殘留，最低檢出限為0.01 μg/g，檢測線性范圍為0.1～10 μg/mL，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3，加標(biāo)回收率為82.9%～86.7%，RSD為5.1%～6.0%。該方法解決了一般采用氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）、高效液相色譜串聯(lián)多級質(zhì)譜（HPLC-MSN）聯(lián)用技術(shù)檢測蜂蜜中氯霉素殘留時儀器昂貴、基層單位難以普及的問題。

周萍等人[16]利用液-液萃取法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測蜂王漿中的氯霉素殘留量，檢測線性范圍為0.5～20 μg/kg，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，檢出限為0.1 μg/kg，加標(biāo)回收率在98.0%～101.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%～2.08%。該方法簡單實(shí)用，樣品無需經(jīng)過固相萃取柱即可富集純化，在質(zhì)譜儀上可達(dá)到與固相萃取相同的檢測效果，能很好地檢測氯霉素殘留量，不產(chǎn)生干擾，使樣品前處理的成本大幅度降低。

李小平等人[17]采用固相萃取-高效液相色譜熒光法同時測定蜂蜜中5種磺胺類藥物的殘留。蜂蜜樣品經(jīng)醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解后，用C18固相萃取小柱富集、凈化、乙腈洗脫，從熒光胺中提取5種磺胺類藥物，以2%醋酸（V/V）溶液-乙腈（50/50，V/V）為流動相，在C18色譜柱上（250 mm×416 mm，5 μm） 分離，熒光法在 λEx=405 nm，λEm=495 nm處測定。結(jié)果5種磺胺類藥物在0.01～0.20 mg/L具有良好的線性，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，加標(biāo)回收率在82.0%～102.5%，RSD均小于5.3%，定量檢出限為0.004 mg/kg。該方法快速、靈敏、簡便、準(zhǔn)確，能滿足實(shí)際工作的需要。

相關(guān)研究人員建立一種快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中20種磺胺類藥物殘留的方法，該方法快速、準(zhǔn)確、高效、靈敏。蜂蜜樣品采用0.1%（V/V）磷酸提取后，MCX固相萃取小柱凈化，快速液相分析色譜柱Shim-pack-XR-ODSII（100 mm×2.0 mm id.，2.2 μm）上，以內(nèi)含 0.1% （V/V）甲酸5 mmol/L乙酸銨的乙腈/水溶液為流動相，采用梯度洗脫。利用超快速液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UFLC-MS/MS）電噴霧電離多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）正離子模式檢測。結(jié)果表明，20種磺胺類藥物除磺胺胍和磺胺醋酰外均在0.25～25.0 μg/kg范圍具有良好的線性關(guān)系，磺胺胍和磺胺醋酰在1.0～25.0 μg/kg范圍具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)>0.99；在0.5，2.5，5.0 μg/kg 3個水平添加時，各被測物的回收率在63.3%～106.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.7%～2.3%，檢出限為0.004～0.25 μg/kg，最低定量檢出限為0.01～0.83 μg/kg。建立的方法可在5.5 min內(nèi)同時測定20種磺胺，是測定蜂蜜中磺胺類藥物殘留的一種高效快速的分析方法。

侯建波等人建立了固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（SPE-LC-MS/MS），同時測定蜂蜜中磺胺類、硝基咪唑類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、吡喹酮六大類54種藥物殘留的方法。生產(chǎn)蜜經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液稀釋、Oasis HLB固相萃取柱凈化后，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測（正離子方式，多反應(yīng)監(jiān)測模式）。采用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法進(jìn)行定量，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.992。方法的定量限（LOQ，以信噪比（S/N）大于10計(jì)）分別為磺胺類和硝基咪唑類藥物1.0 μg/kg，喹諾酮類和林可酰胺類藥物2.0 μg/kg，大環(huán)內(nèi)酯類藥物3.0 μg/kg，吡喹酮0.3 μg/kg。總體回收率為32.6%～114.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～28.9%。該方法的定量限量滿足目前國內(nèi)外藥品的最大殘留限量的要求，可作為蜂蜜相關(guān)藥物殘留量的篩選檢測方法。

Kazuhiro Fujita等人從0.01 mol/L Na2edta-mcllvaine緩沖液（pH值4.0）中提取樣品，用雙苯乙烯二乙苯共聚物柱和銅離子螯合親和色譜柱對樣品進(jìn)行純化富集，最后用HPLC熒光檢測器進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，土霉素、正霉素、金霉素的最低檢出限分別為 0.5，0.7，0.9 ng/g。

劉蓉蓉等人采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，同時測定蜂蜜樣品中4種四環(huán)素族抗生素和3種差向異構(gòu)體的方法。采用Edta-mcilvaine緩沖液提取蜂蜜樣品中的藥物殘留。分別用OASIS HLB和羧酸弱陽離子柱固相萃取柱富集純化，再用流動相洗脫，洗脫液經(jīng)微孔濾膜過濾，用流動相甲酸水-乙腈梯度分離，電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定。在多反應(yīng)監(jiān)測模式下，7種藥物在22 min內(nèi)基本實(shí)現(xiàn)分離和定性定量。樣品在10～500 μg/kg添加范圍內(nèi)，回收率均為64.9%～91.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于10.5%。土霉素及差向土霉素、四環(huán)素及差向四環(huán)素的檢測限為1 μg/kg，金霉素及差向金霉素、強(qiáng)力霉素的檢測限為2 μg/kg。

Nozal MJ等人用液相色譜-光電二級管檢測器-電噴霧電離質(zhì)譜（LC-DAD-ESI-MS）檢測蜂蜜中泰妙菌素的殘留，檢測限為0.5～1.2 μg/kg。

高效液相色譜的特點(diǎn)是在室溫下進(jìn)行分析，特別是對非揮發(fā)性及熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥的分析優(yōu)勢更為明顯，缺點(diǎn)是用于殘留物分析的檢測器還不十分靈敏，這是因?yàn)橹挥猩贁?shù)農(nóng)藥具有天然熒光，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)為農(nóng)藥分析提供了更加便利的條件，使其檢測范圍加大。高效液相色譜法特異性高、精確度高，但是抗生素的含量少時，不易檢測。針對高效液相色譜存在的各種缺陷，聯(lián)用技術(shù)不斷推陳出新，是當(dāng)今蜂產(chǎn)品中抗生素殘留檢測研究最多、最熱門的檢測方法。隨著我國對食品安全工作的重視及儀器和技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜在蜂產(chǎn)品藥物殘留檢測中將得到更廣泛的應(yīng)用。

2.4 生物芯片檢測技術(shù)

生物芯片即生物傳感器，作為一種新型檢測技術(shù)，其操作方便、快速準(zhǔn)確，可以重復(fù)使用和連續(xù)使用，在單一芯片中完成從樣本的預(yù)處理、分離、稀釋、混合、化學(xué)反應(yīng)、檢測到產(chǎn)物提取的全過程，大大提高了檢測速度和分析效率。

生物芯片檢測技術(shù)是國際分析領(lǐng)域前沿檢測技術(shù),對大量檢測樣本具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、抗干擾性、高通量的特點(diǎn)。由瑞典必安科貝爾法斯特研究中心領(lǐng)先研究的生物檢測芯片,被日本貿(mào)易商用于蜂蜜進(jìn)出口檢測。因此，該技術(shù)的發(fā)展可提高我國蜂產(chǎn)品檢測技術(shù)的靈敏度與快速檢測水平，對提升我國出口企業(yè)產(chǎn)品和品牌的美譽(yù)度有一定幫助。

3 結(jié)語

目前，對蜂產(chǎn)品中抗生素殘留檢測的方法較多，檢測限一般低于最大殘留量。色譜法尤其是高效液相色譜法（HPLC）是目前研究藥物殘留最常用的檢測方法，具有高效、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，但前處理比較復(fù)雜；酶聯(lián)免疫法經(jīng)過20多年來的不斷改進(jìn)和發(fā)展，同時伴隨著單克隆技術(shù)的應(yīng)用和抗體提純酶制備技術(shù)的提高，其特異性與靈敏度也有很大提高，該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于檢測農(nóng)獸藥和抗生素殘留，可在基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并被多國政府部門認(rèn)可。但該法存在一定的交叉反應(yīng)，且包被和洗滌2個關(guān)鍵步驟如果操作不當(dāng)，會降低測定的靈敏度和準(zhǔn)確度，不適合做殘留確證，而適用于快速篩選。分析技術(shù)聯(lián)用分析范圍廣、靈敏度高、結(jié)果精確可靠，但所需儀器要求高，不易在基層推廣，多用于殘留確證。

2007年初，農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京）對生物芯片檢測技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，認(rèn)為該技術(shù)對抗生素檢測具有先進(jìn)性、實(shí)用性和廣闊的開拓前景，但現(xiàn)階段其發(fā)展受到很多相關(guān)技術(shù)的制約，如費(fèi)用高、技術(shù)復(fù)雜等，相信隨著技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)部門的不斷投入，各具特色的生物芯片檢測技術(shù)將是蜂產(chǎn)品中抗生素殘留檢測的重要工具。

蜂蜜被廣泛用于食品、醫(yī)藥和保健品工業(yè)中。我國近幾年的蜂類產(chǎn)品的貿(mào)易量主要為28～30×104t，主要銷量往歐盟、美洲、日本等地。目前，蜂產(chǎn)品中氨基糖苷類抗生素的殘留阻礙了蜂產(chǎn)品的出口，原因是蜂蜜中氨基糖苷類抗生素容易引起人的障礙性貧血，對于人類的身體健康其實(shí)是有著比較大的潛在危害。因此，提高我國蜂蜜殘留的檢測水平，是保障蜂蜜中殘留的氨基糖苷類抗生素符合進(jìn)出口貿(mào)易限量標(biāo)準(zhǔn)的有效手段。