提高和牛冷凍精液生產質量關鍵措施

丁麗艷 韓永勝 李同豹 李平

（黑龍江省畜牧研究所150000）

1 和牛種子公牛的選擇

種子公牛的質量是生產高質量精液的前提和保障，對牛群的發展及品種改良起著重要作用。選擇依據的標準主要包括系譜、自身、后裔選擇。根據系譜選擇其父母代繁殖性能、各階段體重與增重、飼料報酬及與肉用性能有關的外貌表現都良好的后代，并經過后裔測定合格留作種用。

對和牛種公牛自身的選擇，包括生長發育、體質外貌、體尺體重、早熟性及精液質量等性狀。要求全身結構勻稱，健康無疾病，體質強壯，精神狀態好，毛皮光滑，體況良好，膘情適宜，雄性特征明顯，生殖器官發育良好，睪丸大小正常，有彈性。當小牛長到1歲以上就可以直接測定其某些經濟性狀，如12月齡以上的活重、育肥期增生效率等。選擇適宜于遺傳力高的性狀。精液質量好，正常情況下鮮精活力不低于0.7，畸形精子不高于20%。

2 種公牛的培育

2.1 飼養

種公牛的繁殖性能、精液質量與飼料有密切相關。種公牛的飼料要求必須營養全價、種類多樣、搭配合理、適口性好、易于消化。飼喂種公牛時要多飼喂高蛋白和青干飼料，少喂能量飼料和多汁飼料。飼料中除了一些基礎類營養物質外，還要注意其他一些微量營養物質的含量，如VA、VE、鋅、銅、鐵、硒等的缺乏會導致精子數量減少、活力降低、畸形率增加，受胎率降低。除了飼料營養外，還要保證飼料品質，嚴禁飼喂發霉變質的飼料。由于青貯飼料飼喂過量會影響種公牛精液的品質，飼喂時要掌握好飼喂量，一般每天保證每天飼喂10kg以下。

非采精期和采精期種公牛的飼養方法和營養需求不同。種公牛在非采精期營養的供給主要為了抓膘復壯，為采精打下良好的身體基礎，因此，要給足草料，防止種公牛掉膘，但同時也要注意避免飼喂過肥，否則會影響性欲和精液質量，精料飼喂量為2～3kg/d；采精期需要營養充足，要提高日糧的營養水平，尤其蛋白質水平，避免種公牛在采精期掉膘，并生產出優質的精液，精料的飼喂量為4～5kg/d。

2.2 管理

種公牛要有專人進行飼養管理，不可以隨意更換。要求管理人員膽大心細，溫柔對待公牛，嚴禁抽打。定期（3個月左右）對種公牛進行稱重，使種公牛保持中等膘情，根據稱重結果及時調整飼喂方法或飼料配方，防止牛只過肥。要加強對種公牛外生殖器官的護理，定期按摩。

種公牛要保證有充足的運動量，適當運動可保持種公牛強健的體質，使牛身體健康、行動靈活、易于配種，性情溫順，還可保持較為旺盛的性欲，提高精液質量。舍飼種公牛每天保證有2h的運動量；每天刷拭牛只被毛1～2次，重點刷頭部和頸部，這樣能保持體表衛生、減少體外寄生蟲病、促進血液循環作用?？刂坪梅N公牛的采精頻率，一般在18月齡時開始采精，剛開始時每隔10～15d采精1次，以后可增加至每隔3～4d采精1次，采精頻率還要根據季節的變化合理安排，夏季可每周采精1次，并在早上或者傍晚較為涼爽時進行，冬春季節可每周2次。種公牛在3～4歲時精液質量最佳，要把握好這個時機，5歲以后繁殖機能開始下降。

溫度對精液的品質影響較大，尤其是高溫，如果溫度超過31℃會使種公牛產生熱應激，導致種公牛的食欲減退，采食量下降，體況不佳。牛體溫度升高后會引起陰囊和睪丸的溫度升高，影響精子生成，還會導致精子的各項指標不達標，因此，要加強種公牛夏季的防暑降溫工作，可以在牛舍和運動場周圍搭設涼棚或種植樹木。注意牛舍的通風，給牛飲用清涼的井水，并適當喂鹽水。采精時要盡量避開高溫時段，并減少采精次數。

⑤手術目標：為了降低術后并發癥發生率，在手術治療過程中，應嚴格遵守無菌操作原則。術后應加強呼吸護理、胸管護理[2]。由于肺部手術患者創傷性較大，術后保持呼吸通暢較為困難，因此患者術后需持續吸氧，并定時對患者進行拍背咳痰，在拍背時需注意控制力度，當痰液過于粘稠時，需進行霧化吸入，口服化痰藥物。保證患者有效排痰、呼吸通暢，預防呼吸衰竭或肺部感染。

合理防疫，做好疫苗接種工作，減少免疫使種公牛產生應激反應，否則會導致精液品質下降。在注射疫苗期間要加強日糧中營養物質的濃度，以減少應激，在生產中應合理安排疫苗注射時間，并盡量減少免疫次數，避開精液生產的高峰期，以減少接種疫苗對精液的毒性作用。

2.3 采精訓練

種公牛的采精訓練對生產高質量的精液及種公牛的使用年限非常關鍵。

對種公牛訓練過早、過晚都不利于優質種公牛繁殖性能的發揮。訓練過早，種公牛未達體成熟，不僅會抑制公牛正常發育及健康水平，生產的精液品質也較差。訓練過晚，不但訓練困難，而且優質種公牛利用年限縮短，效益降低，因此，為了充分發揮和牛公牛的種用價值，對其訓練的最佳時期是18月齡以前。

訓練時間最好選擇清晨，訓練之初，采用觀摩其他公牛采精的方式來訓練，在訓練采精前，將發情母牛的分泌物涂于臺牛尾部，以此刺激公牛性興奮，要杜絕采用打罵等暴力行為對待公牛，以免抑制其性活動，無法正常調動公牛性興奮。

3 冷凍精液科學的生產程序

3.1 前處理

3.1.1 種公牛和臺牛的處理

種公牛在采精前要進行清潔消毒處理，防止精液受細菌等污染，影響精液質量。采精前用清水擦洗公牛下腹部，并用0.1%高錳酸鉀溶液洗凈包皮并擦干；臺牛應選擇大小適中，性情溫和的健康母牛，洗凈并消毒臺牛后軀部、肛門、會陰、尾根等部位，將臺牛固定在采精架內，拴好尾部。

3.1.2 器材的準備

采精所用的器材、設備等必須經過清洗和消毒處理。采精筒等塑料、橡膠用品每次用完后拆卸下來，先用洗潔精水清洗，然后用流動水沖洗干凈，再用蒸餾水清洗，晾干后用75%酒精擦拭消毒，蒸發干后放于無菌操作臺內，用紫外線消毒30min后備用。集精杯、試管、容量瓶、燒杯、試管、量筒、玻璃棒等玻璃器材先用洗潔精水浸泡后刷洗，然后用流動水沖洗，再用蒸餾水清洗后，晾干，用錫箔紙封口，放入干燥箱內，用干熱消毒法，維持180℃，1h。紗布、工作服等物品采用高壓蒸汽消毒，壓力121磅，維持30min。配制的稀釋液經0.22μm過濾器進行過濾消毒。

3.1.3 稀釋液的配制

基礎液Ⅰ液：蒸餾水100ml，檸檬酸鈉2.97g，卵黃10ml；

基礎液Ⅱ液：取第一液41.75ml，加入果糖2.5g，甘油7ml。

上述稀釋液，每100ml加入青霉素、鏈霉素各5萬～10萬IU。

3.2 精液的采集

利用假陰道法，采用兩次間隔爬跨法采集精液。采精時將公牛引至臺牛后面，采精員站在臺牛后部右側，右手握持備好的假陰道。當公牛準備起步爬跨時，采精人員用左手取下蓋假陰道入口的滅菌紗布；公牛爬跨后迅速用左手準確托握公牛包皮，將陰莖導入假陰道入口，使假陰道靠在臺牛臀側，隨后公牛的后軀向前一沖即完成射精。當公牛滑下時，采精人員持假陰道隨公?；?，迅速而自然地取下假陰道，將假陰道直立并重新蓋上滅菌紗布。打開開關，放出空氣和部分熱水，以便精液完全流入集精杯內。然后取下集精杯，蓋上集精杯蓋，貼上標簽后送入精液檢查處理室。

3.3 精液的檢測及稀釋

從遞精液窗口內將精液放入精液處理室。將精液倒入事先準備好的試管中，用膠頭滴管在中間部位取出一滴放入載玻片上，蓋上蓋玻片在顯微鏡下鏡檢。利用密度儀和電子天平稱量重量，輸入精子活力值后，儀器會自動輸出稀釋倍數，根據數值進行稀釋。一般鮮精活力在0.7以上，8億/ml為合格新鮮精液。裝有稀釋液的瓶子放入盛有溫水（35℃）的塑料杯中，防止溫度變化過快，對精子打擊后活力降低。

3.4 精液的分裝

稀釋后精液進行灌裝、打印。將稀釋后的精液輕輕搖勻后緩慢倒入塑料瓶中，灌裝過程要檢查打印是否清晰，封口是否完整，裝管量是否合適，過少或過滿都要挑選出來以廢棄，分裝過程要快，防止溫度變化過快對精子的影響。

3.5 精液的平衡

分裝好的細管精液放入4℃的冷柜中平衡4h。平衡可以使稀釋液中的抗凍劑-甘油通過精子細胞膜進入細胞質內，使細胞內外達到離子平衡，使精子耐受低溫冷凍。

3.6 精液的冷凍及保存

應用自動冷凍儀進行冷凍處理。將控制溫度先輸入電腦內，然后按照輸入程序進行冷凍。-15～-50℃是精子受危害最大的溫度區域，容易形成冰晶，對精子造成死亡。

當細管冷凍溫度達到-140℃以后打開冷凍儀，取出細管凍精，用分裝儀在液氮中將細管精液分裝于25支小桶內，投入液氮灌中保存待檢。

4 冷凍精液質量檢測

4.1 活力檢測

取兩支和牛細管冷凍精液，37℃水浴中解凍，用吸水紙擦干細管上的水分，剪去封口端，把精液推入試管內并混勻，用移液器先后吸取混勻后精液10μl，兩次分別放入兩個載玻片上，蓋上蓋玻片后，在顯微鏡下觀察活力，取兩次活力平均值為待檢批次精液活力值，凍解后活力值在0.35以上則為合格冷凍精液。

4.2 畸形率檢測

取一支細管冷凍精液，37℃水浴中解凍，用吸水紙擦干細管上的水分，剪去封口端，把精液推入試管內并混勻，用移液器吸取混勻后精液10μl滴于潔凈載玻片一端，用另一邊緣光滑的凹玻片與載有精液樣品的載玻片呈35℃夾角向前推，將樣品均勻地涂于載玻片上，自然風干，同樣制作兩個抹片。在風干的抹片上滴1.0～2.0ml中性福爾馬林固定液，固定15min后用清水緩慢沖掉固定液，然后自然風干。再將風干的抹片反扣在帶染色板上，把姬姆薩液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，1.5h后用清水緩慢沖去染液，晾干后放在顯微鏡下觀察，每個抹片觀察300個精子，觀察時選取載玻片的中間部位，取兩抹片觀察的平均值，精子畸形率低于20%的精液為合格精液。

4.3 細菌數檢測

取兩支細管冷凍精液，37℃水浴中解凍，用吸水紙擦干細管上的水分。在超凈工作臺內點燃酒精燈，平皿蓋上做好標記，用酒精棉球消毒整支細管，酒精燈下灼燒法消毒細管剪后，待剪降溫后，剪去超聲波封口端，將整支細管精液注入滅菌平皿內。及時將53℃水浴內的營養瓊脂培養基注入平皿約10～15ml，并轉動平皿混合均勻。同時，將營養基瓊脂培養基傾入滅菌平皿內作空白對照，待瓊脂凝固后，翻轉平板，置37℃恒溫培養箱內培養48h后立即計數。做平板菌落計數時，應在光線較強處，用肉眼觀察，輔助放大鏡觀察，避免遺漏，可用菌落計數器計數。取兩個平板菌落的平均數減去空白樣板菌落數為待檢精液每支細管菌落數，每支細管（0.25ml）精液培養菌落數大于1000個為不合格。

檢驗合格的冷凍細管精液才可用于生產。