PEDF對氧誘導視網膜病變小鼠視網膜MCP-1表達的影響

王亞娜，張 磊

0引言

視網膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)的形成是缺血缺氧性視網膜病變中最重要的病理過程，病變進一步發展可導致視功能不可逆性損害甚至喪失[1]。越來越多的研究表明，色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)兼具抑制新生血管形成和神經保護的作用[2]。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是趨化因子家族中的主要成員之一，在腫瘤、炎癥、視網膜色素變性和糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)等缺血缺氧性疾病中起著重要的作用。本研究通過建立氧誘導視網膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠模型，觀察PEDF對視網膜新生血管和MCP-1表達的影響，旨在進一步探討PEDF對缺血缺氧性視網膜病變的保護作用和機制，為PEDF治療缺血缺氧性視網膜病變提供理論依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物C57BL/6J新生小鼠160只，7日齡，雌雄不限，清潔級，由上海市瑞金醫院動物房提供，動物飼養條件符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.1.2主要試劑和儀器重組PEDF蛋白(美國Peprotech公司)；熒光標記的GS-Isolectin B4(Vector Laboratories)；RIPA裂解液(美國Sigma公司)；BCA試劑盒(美國Thermo Scientific公司)；5%脫脂奶粉；SYBR green PCR試劑盒(日本Takara公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；PEDF兔抗單克隆抗體一抗(sc-25594，美國Santa Cruz公司)，MCP-1兔抗單克隆抗體一抗(ab25124，美國Abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔抗單克隆抗體一抗(ab9485，美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(碧云天生物技術公司，A0208)；PVDF膜(美國Millipore公司)；Quantity One圖像處理系統、蛋白電泳系統(美國Bio-Rad公司)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠OIR模型的建立采用隨機數字表法將160只7日齡小鼠分為正常組(24只)、正常對照組(16只)、OIR模型組(40只)、PBS治療對照組(40只)、PEDF藥物治療組(40只)。參照既往方法[3]制作OIR模型。取7日齡C57BL/6J新生小鼠與哺乳母鼠共同置于氧濃度為(75±2)%的氧環境內飼養5d，然后返回正常氧環境中飼養5d，建立OIR模型；正常組及正常對照組小鼠始終置于正常氧環境飼養。

1.2.2小鼠玻璃體腔注射所有小鼠均取右眼為實驗眼。參照既往PEDF玻璃體腔注射的方法[4]，12、14日齡時PEDF藥物治療組和PBS治療對照組小鼠玻璃體分別注射等量的PEDF(1μL，2μg/μL)和PBS(1μL，10mmol/L，pH=7.4)；正常組小鼠不作任何干預，正常對照組小鼠分別于12、14日齡時玻璃體腔注射等量PBS(1μL，10mmol/L，pH=7.4)，注射后氧氟沙星眼膏涂眼預防感染。

1.2.3小鼠視網膜鋪片和染色造模結束17日齡時，所有小鼠過量麻醉處死。各組隨機抽取8只小鼠摘除右眼球，立即浸泡于40g/L多聚甲醛溶液中固定2h，手術顯微鏡下用角膜剪沿眼球的角鞏膜剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體和玻璃體，分離出完整視網膜組織，用PBS(10mmol/L，pH=7.4)漂洗后以1∶50稀釋的GS-Isolectin B4染色液對游離視網膜進行染色，室溫避光45min～1h；用PBS漂洗后在手術顯微鏡下以視盤為中心做5～6個放射狀切口，平鋪于載玻片上，樹脂膠封片。全部視網膜分為5～6瓣，熒光顯微鏡下照相，觀察是否出現血管迂曲擴張、微血管瘤和新生血管的形態。Image Pro Plus 6.0計算各組RNV面積進行統計。

1.2.4Western-blot檢測視網膜組織中PEDF和MCP-1蛋白的表達造模結束后(P17)，所有小鼠過量麻醉處死。手術顯微鏡下分離取出所有小鼠視網膜，液氮迅速冷凍后轉移至-80℃冰箱保存。取出冰箱中保存的各組視網膜放入勻漿杯中，4℃條件下12000g離心10min后，加入預冷的蛋白裂解液200μL，冰上作用30min，振蕩混勻，4℃條件下14000g離心15min后取上清液提取蛋白，后酶標儀測蛋白濃度，計算含40μg蛋白的溶液體積為上樣量，與蛋白上樣緩沖液混合后100℃加熱5min使其變性，常規聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法將蛋白轉移至硝酸纖維薄膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1～2h，三羥基甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)洗膜后分別加入按1∶100稀釋的PEDF、MCP-1一抗以及1∶1000稀釋的GAPDH一抗；4℃搖床過夜后洗膜，分別加入1∶500稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的相應二抗。室溫下孵育2h，TBST洗膜10min×3次。進行ECL化學發光顯色并拍照，以GAPDH作為內參照。用GIS-2020凝膠圖像分析系統掃描蛋白條帶的光密度(OD)值，以目的蛋白與內參蛋白GAPDH OD值的比值作為目的蛋白的相對表達量，并依此進行統計分析。

圖1全視網膜鋪片染色觀察各組視網膜新生血管形態的變化(×400) A：正常組；B：OIR模型組；C：PBS治療對照組；D：PEDF藥物治療組。

1.2.5RT-PCR檢測視網膜組織中PEDF和MCP-1mRNA的表達取出冰箱中保存的各組視網膜，每組隨機取8個視網膜樣本，Trizol試劑一步法提取總RNA，分光光度計測定A260、A280及其濃度，根據A260/A280和A280/A260的比值鑒定總RNA純度，后逆轉錄合成cDNA第一鏈。各引物序列利用Gene Runner軟件設計并經NCBI BLAST檢索無顯著同源性序列，引物設計合成：PEDF上游引物：5’-TCTGGGAGCTGAACATCGA-3’，下游引物：5’-GGGCAGTAACAGAGGCAAG-3’；MCP-1上游引物：5’-ACTGAAGCCAGCTCTCTCTTCCTC-3’，下游引物：5’-TTCCTTCTTGGGGTCAGCACAGAC-3’；β-actin上游引物：5’-CTTCTTTGCAGCTCCTTCGT-3’，下游引物：5’-GTGCCAGATCTTCTCCATGT-3’。采用SYBR green PCR試劑盒優化反應條件，使目的基因和管家基因的擴增效率保持一致，接近于1。ABI Prism 7500-HT定量PCR儀擴增，反應完成后，軟件進行自動數據分析，2-△△Ct表示目的基因相對表達量。每組8個樣品，實驗重復3次。

2結果

2.1PEDF對氧誘導小鼠視網膜新生血管的影響各組小鼠視網膜血管染色鋪片顯示，造模結束時(P17)，正常組小鼠視網膜血管呈放射狀自視盤發出，走形平滑自然，分支良好(圖1A)；OIR模型組和PBS治療對照組小鼠視網膜中央均出現程度不同的無血管化區及迂曲擴張的放射狀新生血管叢，新生血管成簇或成團分布(圖1B、C)；PEDF藥物治療組小鼠視網膜新生血管團較PBS治療對照組明顯減少(圖1D)。統計分析顯示：正常組、OIR模型組、PBS治療對照組、PEDF藥物治療組病理性新生血管面積分別為1.055±0.163、8.538±0.975、6.860±1.397、2.306±0.984mm2，組間差異有統計學意義(F=93.386，P<0.001)。OIR模型組、PBS治療對照組小鼠視網膜新生血管面積較正常對照組都增高，差異有統計學意義(均P<0.01)；PEDF藥物治療組小鼠視網膜新生血管面積較PBS治療對照組顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)；正常組小鼠視網膜新生血管面積與PEDF藥物治療組比較，差異無統計學意義(P=0.121，圖2)。

圖2各組小鼠視網膜新生血管面積的比較bP<0.01vs正常組；dP<0.01vsPBS治療對照組。

圖3Westernblot檢測正常組和OIR模型組視網膜PEDF和MCP-1蛋白表達量A：PEDF；B：MCP-1。

2.2氧誘導視網膜病變中MCP-1、PEDF蛋白和mRNA的表達Western-blot檢測結果顯示，與正常組小鼠視網膜PEDF蛋白的相對表達量相比，OIR模型組小鼠視網膜PEDF 蛋白相對表達減少，差異有統計學意義(0.82±0.44vs0.55±0.23，t=5.67，P<0.01，圖3A)。與正常組小鼠視網膜MCP-1蛋白的相對表達量相比，OIR模型組小鼠視網膜MCP-1蛋白相對表達增加，差異有統計學意義(0.45±0.06vs0.88±0.10，t=5.61，P=0.04，圖3B)。

RT-PCR檢測結果顯示，與正常組小鼠視網膜PEDF mRNA的相對表達量比較，OIR模型組小鼠視網膜PEDF mRNA相對表達減少，差異有統計學意義(0.27±0.03vs1，t=3.35，P<0.01，圖4A)。與正常組小鼠視網膜MCP-1 mRNA的相對表達量比較，OIR模型組小鼠視網膜MCP-1 mRNA相對表達增加，差異有統計學意義(3.63±1.05vs1，t=4.43，P=0.046，圖4B)。

2.3PEDF對氧誘導視網膜病變中MCP-1蛋白和mRNA表達的影響Western-blot檢測結果顯示，各組間差異有統計學意義(F=17.12，P<0.01)，PEDF藥物治療組MCP-1蛋白的相對表達量(0.30±0.15)較PBS治療對照組(0.78±0.11)顯著減少，差異有統計學意義(P<0.01)；PEDF藥物治療組MCP-1蛋白的表達量較正常對照組(0.28±0.10)升高，但差異無統計學意義(P>0.05，圖5)。

RT-PCR檢測結果顯示，正常對照組、PBS治療對照組、PEDF藥物治療組視網膜MCP-1 mRNA相對表達量分別為1、17.63±7.58、3.47±2.34，三組間差異有統計學意義(F=3.842，P=0.041)。PBS治療對照組小鼠視網膜MCP-1 mRNA相對表達量較正常對照組增高，差異有統計學意義(P=0.019)；PEDF藥物治療組小鼠視網膜MCP-1 mRNA相對表達較PBS治療對照組減少，差異有統計學意義(P=0.042)；正常對照組小鼠視網膜MCP-1 mRNA相對表達量與PEDF治療組比較，差異無統計學意義(P=0.707，圖6)。

圖4RT-PCR檢測正常組和OIR模型組視網膜PEDF和MCP-1mRNA相對表達量A：PEDF；B：MCP-1；aP<0.05，bP<0.01vsOIR模型組。

圖5Westernblot檢測各組視網膜MCP-1蛋白的相對表達量。

圖6RT-PCR檢測各組視網膜MCP-1mRNA相對表達量aP<0.05vsPBS治療對照組。

3討論

諸多致盲性眼病如年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、視網膜中央/分支靜脈阻塞和早產兒視網膜病變等的病理基礎在于視網膜膜微血管異常，缺血缺氧致RNV形成[5-6]。越來越多的研究表明，PEDF在缺血缺氧性視網膜病變中發揮重要作用[2,7]。同時關于炎癥趨化因子MCP-1在缺血缺氧性視網膜病變中的作用也日漸顯現[8-10]，PEDF作為抑炎因子，兩者是否存在某種關聯尚未闡明。本研究通過建立OIR小鼠模型模擬缺血缺氧性視網膜病變，再用重組PEDF玻璃體腔注射進行干預，觀察PEDF對氧誘導視網膜新生血管形成及對炎癥因子MCP-1表達的影響，并進一步探討PEDF對缺血缺氧性視網膜病變的保護作用。

PEDF最初是從胎兒視網膜色素上皮細胞培養液中分離出來的一種糖蛋白，具有營養神經、抗炎等多種生物學作用而于近年來備受關注。既往研究證實PEDF具有促進視網膜和中樞神經系統神經元生長和分化的功能[11]，同時還具有抑制視網膜、玻璃體和角膜血管形成的作用[12]。組織中高水平的PEDF還可以抑制缺血性視網膜病變中的細胞凋亡、抑制視網膜和脈絡膜新生血管的形成[13]。既往研究還發現視網膜細胞產生PEDF的量與氧濃度呈正相關[14]，但其機制尚不清楚。研究顯示早產兒視網膜病變患者玻璃體中PEDF蛋白表達水平較對照組明顯降低[15]。Notari等[16]利用動物和細胞模型證實缺氧顯著下調由色素上皮細胞產生的PEDF，而這一過程是通過細胞外基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)介導的蛋白降解作用實現的，PEDF對于缺氧或血管內皮生長因子誘導的蛋白降解很敏感。PEDF的低表達進一步促進RNV的生成和神經節細胞的死亡。本研究中OIR小鼠視網膜PEDF的表達較正常組明顯降低，同時病理性新生血管顯著增生，這與既往研究相一致。

在實驗性糖尿病視網膜中，PEDF作為眼內最強的抑炎因子之一，能夠減少促炎因子的表達[17]。而多種視網膜病變的病理過程往往有免疫炎癥因素參與。我們前期研究[18]表明，缺氧情況下PEDF可能通過下調視網膜Müller細胞中白細胞介素1-β的表達，上調Müller細胞谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和谷氨酸/天冬氨酸轉運體(glutamate/aspartate transporter，GLAST)的表達，從而改善谷氨酸循環而發揮神經保護作用。同時缺氧情況下PEDF可能通過下調視網膜白細胞介素1-β的表達，以抑制RNV的形成[3]。Park等[19]利用大量表達PEDF的轉基因小鼠制作OIR模型，研究發現氧誘導后的PEDF轉基因小鼠視網膜RNV和視網膜炎癥因子較氧誘導后的野生小鼠明顯減少。在激光誘導脈絡膜新生血管模型中，與野生型小鼠相比，PEDF轉基因小鼠視網膜中炎癥因子、血管內皮生長因子、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、MCP-1、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosises factor-α，TNF-α)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)mRNA表達明顯降低。其中趨化因子MCP-1具有趨化單核細胞和T淋巴細胞聚集并激活單核細胞和巨噬細胞的作用，其不僅是參與炎癥的重要因子，還參與正常血管的發育和病理性新生血管的形成[20]。糖尿病視網膜損傷中單核細胞與巨噬細胞聚集，促進糖尿病視網膜病變的進展[21]。而且，玻璃體中MCP-1的表達水平與PDR的嚴重程度密切相關[8]。Yoshida等[9]研究顯示，缺血性視網膜病變中MCP-1和巨噬細胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)與RNV形成有關，同時兩者還參與了炎癥反應的過程。董寧等[10]研究證實，小鼠視網膜發育過程中始終伴隨著MCP-1的表達，MCP-1的表達上調可能與小鼠視網膜血管發育和OIR模型中RNV的形成密切相關。本研究亦顯示OIR小鼠于17日齡時視網膜MCP-1蛋白與mRNA表達較正常組均上調。

結合PEDF的抗新生血管形成及其抑炎作用，那么缺血缺氧條件下PEDF能否抑制視網膜MCP-1的高表達？為此，本研究采用玻璃體腔注射的方法對OIR小鼠視網膜進行PEDF干預，結果顯示其較PBS治療對照組MCP-1表達水平明顯降低、新生血管面積顯著減少，提示在缺血缺氧環境下，PEDF能夠抑制視網膜MCP-1的高表達，而且PEDF可能通過下調MCP-1的表達而減弱或抑制RNV的形成。既往研究顯示，與對照組病例相比，PDR患者和糖尿病黃斑水腫患者玻璃體中均有高水平的IL-6、MCP-1和VEGF蛋白表達量，而PEDF蛋白表達量則顯著下調[22-23]。同時在DR動物模型中，玻璃體腔注射低劑量的PEDF即可降低視網膜血管通透性，而且PEDF玻璃體腔注射組較對照組視網膜中炎癥因子VEGF、ICAM-1和MCP-1水平均有明顯的降低[17]，這與本研究結果一致?，F有研究證實葡萄膜炎患者房水中PEDF的表達水平亦與MCP-1密切相關[24]；在培養的人微血管內皮細胞中，PEDF抑制晚期糖基化終產物誘導的活性氧生成以及后續MCP-1 mRNA和蛋白的高表達，而PEDF的替代物可以通過抑制晚期糖基化終產物的不利因素來抑制DR的發展進程[25]。因此，缺血缺氧條件下，PEDF可能通過抑制MCP-1的表達從而減弱或抑制單核細胞與巨噬細胞聚集，最終發揮其抑制RNV形成的作用。

綜上，本研究利用OIR小鼠模型觀察了缺血缺氧環境下PEDF對RNV的形成和MCP-1表達的影響，證實了PEDF能夠下調氧誘導視網膜病變中視網膜MCP-1的表達，這可能是其抑制RNV形成而發揮視網膜保護作用的機制之一。這為將來尋找RNV潛在治療靶點提供了新的思路。但本實驗還存在一些缺陷，比如尚缺乏PEDF對MCP-1相關效應細胞的影響以及MCP-1誘導RNV形成的直接證據，因此需要更深入的研究。