Exosomes在骨代謝疾病中作用的研究進展

高坤 朱文秀 李全 李亨 余偉吉 王立新 曹亞飛*

1.深圳市中醫院骨傷科，廣東 深圳 518000 2.北京中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳 518100

骨代謝疾病尤其是骨質疏松癥是高發的老年疾病之一，嚴重影響老年人的生活質量，但其發病機制尚未完全明確。骨代謝過程中成骨細胞和破骨細胞扮演重要的角色。調節成骨細胞和破骨細胞在分化礦化方面的平衡是治療類似于骨質疏松癥的系統性骨代謝疾病的先決條件[1]。成骨細胞和破骨細胞之間存在信息交流機制，該機制錯綜復雜，大量的信號分子、細胞因子參與調控。深入研究不同信號分子的調控作用對于骨代謝疾病的診斷和治療具有重要的臨床意義。

外泌體(Exosomes)是細胞內部的胞內體與細胞膜融合釋放到細胞外，直徑大小為30～120 nm的膜性囊泡[2]。在過去的幾年中，這些納米級別的顆粒已經在癌癥進展、免疫應答、藥物載體的研究方面取得了顯著的成果，但在骨代謝疾病方面研究匱乏。Exosomes可以轉運基因物質以進行細胞與細胞之間的交流，能夠從新的角度揭示疾病的發病機制，從而為疾病的診斷治療提供新的思路。近期有部分研究人員對骨代謝相關Exosomes進行了研究，包括成骨細胞、破骨細胞、骨細胞、骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)等，取得了一些研究成果。因此，本文對Exosomes在骨代謝過程中的作用及角色進行總結及分析，以期能夠對骨代謝疾病的基礎研究和臨床防治提供新的方向和參考。

1 Exosomes的定義

大部分的真核細胞都能分泌具有細胞間交流能力的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，這些不均勻封閉的膜結構具有影響臨近和遠處細胞的能力。根據起源及生物特性可以將胞外囊泡分為3類：凋亡小體(apoptotic bodies)、微粒(microvesicles)和外泌體(exosomes)[2]。1970年Rose Johnstone在網織紅細胞中發現并首次提出Exosomes一詞，然后Laulagnier等從細胞系中剝離到有蛋白酶活性的微粒。1990年之前，Exosomes一直被當作細胞代謝產物的運輸體，直到β-cell分泌的Exosomes發現具有轉運抗原的功能才被引起重視。其包含有大量的蛋白分子、DNA、RNA、mRNA及microRNA，能夠通過細胞間的傳遞發揮重要作用。在腫瘤免疫調控、炎性通路調節、分子標志物、藥物裝載等方面研究及應用廣泛[3]。

2 骨組織Exosomes的提取過程及成分組成

在Exosomes的研究中，為了能夠更好地進行免疫實驗、診斷標志物研究，或作為治療和生存率的預測分子，其提取過程至關重要，不能在提取過程中降低其純度和損失其生物活性[4]。目前很多的商業試劑盒能夠對體液中Exosomes進行分離和富集，包括超速離心法、透析膜過濾法、磁珠分選法、流式分選法[5-7]，各種不同的收集方法都具有一定的優缺點[8]。超速結合差速離心是利用Exosomes密度進行分離的經典方法[9]，在血清、血漿、尿液等體液中應用廣泛。在骨組織的研究中，骨細胞來源的Exosomes可以應用超速結合差速離心直接提取，而在骨組織內部的，如骨髓來源的Exosomes，則需要將骨髓先提取出來再進行下一步分離。光學方法是最常用來精準地觀測Exosomes的運動的，最常用的光學方法是納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)，能夠對液體樣本內的Exosomes尺寸大小及密度進行測量。動態光散射(dynamic light scattering，DLS)也被用作測量骨來源的Exosomes的尺寸大小。DLS通過激光檢測顆粒的布朗運動，分析懸浮粒子及其強度散射光的波動。電鏡是被廣泛應用于檢測Exosomes特征的非光學的儀器。電鏡的作用原理是在光學顯微鏡的基礎上，用電代替光線從而產生圖像。然而，由于電鏡要在真空中進行，Exosomes的檢測需要固定和脫水，而該過程會影響其尺寸及形態[10]。在軟骨和骨膜內的近期研究中，研究者發現幾個被轉移的內源性的蛋白缺少胞外基質(extracellular matrix，ECM)的信號肽段。比較顯著的就是兩個ER常駐蛋白葡萄糖調節蛋白-78(glucose regulatory protin-78，GRP-78)和TGF-β受體II相互作用蛋白1(TGF-beta receptor II interacting protein1，TRIP-1)，這兩個蛋白是定位于ECM而不含信號肽段[11]。骨髓間充質干細胞來源的Exosomes被明確鑒定的存在標志物蛋白CD9/CD63/CD81(27、28)。骨髓基質細胞來源的Exosomes則含有熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)、閥蛋白-1(flotillin-1)[12]。最近有研究用質譜檢測了成骨細胞分泌的外泌體的1 536個蛋白，發現其中的172個蛋白與骨組織數據庫中的蛋白重合[13]。更進一步通過蛋白質組分析，檢測到蛋白包括ephrinB1蛋白(EFNB1)、轉換生長因子受體3(TGFBR3)、脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)、骨形態蛋白受體1(BMPR1)、Smad泛素化調控因子-1(SMURF1)，這些蛋白在骨組織疾病中均有重要功能。除了蛋白，骨組織來源的Exosomes內各種的核酸也被鑒定出來[14]。有研究將骨髓間充質干細胞成骨分化過程中分泌的Exosomes內miRNA的不同進行了鑒定，發現let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、 miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302b明顯升高，miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a和miR-320c降低。進一步發現7個mRNA，包括RPS2、DGKA、ACIN1、DKK2、Xsox17、DDX6和Lsm2表達具有差異。

3 Exosomes在骨量丟失中的角色

骨組織是一個在成骨細胞促進合成、破骨細胞促進分解，協調進行的不斷建模和修復的過程。成骨細胞與破骨細胞之間相互交流，交流過程復雜，牽涉到激素、生長因子、mRNA和miRNA。對骨組織中的Exosomes進行研究，發現Exosomes能夠直接影響成骨細胞、破骨細胞和骨髓間充質干細胞以調控骨的結構及代謝。成骨細胞來源的Exosomes包含有骨調節蛋白，能夠刺激破骨細胞的結構，是骨組織進行細胞間交流的機制之一。核因子Κβ配體活化受體(receptor activator of nuclear factor kappa beta ligand，RANKL)隸屬于TNF家族，在骨代謝的過程中有重要作用，能夠調控破骨細胞的激活。成骨細胞分泌的Exosomes包含有RANKL，甲狀旁腺激素能夠促進RANKL的釋放，攜帶RANKL的Exosomes能夠進入破骨細胞內起到傳遞RANKL的作用[15]。有研究證實老年患者的Exosomes與年輕患者相比，更加能夠抑制骨的生成，并且該抑制作用與半凝乳素蛋白(Galectin-3)相關[16]。Galectin-3在老年患者的Exosomes中減少，體外實驗中Galectin-3的過表達能夠引起BMSCs成骨分化能力的增強。骨化成骨細胞來源的Exosomes已經被證實包含有miRNAs，例如miR-1192、miR-680、miR-302a，這些Exosomes能夠被BMSCs吞噬從而刺激成骨性分化。Exosomes激活BMSCs成骨分化的機制是Exosomes內的miRNAs能夠激活Wnt/β-catenin通路[17]。Wnt/β-catenin通路是BMSCs分化的關鍵調控通路，而Wnt通路的激活能夠抑制PPARγ、CCAAT增強結合蛋白的表達，激活成骨因子Runx2、Dlx5和Osterix的表達。

4 干細胞來源Exosomes在骨組織再生修復中的角色

在過去的幾年，骨組織修復再生領域中Exosomes的作用被引起重視。干細胞分泌的Exosomes已經被用在幾項再生應用中[18-19]。報道顯示特異性蛋白、mRNA和miRNA能夠從Exosomes中橫向轉移至臨近或遠處細胞以激活疾病組織中的再生程序[20]。Furuta研究顯示間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)Exosomes是MSC旁分泌信號的重要分子之一。與對照組相比，注射MSC-exosomes能夠增強骨折的愈合。最近，MC3T3-E1細胞來源的Exosomes被用來促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化。該研究發現Exosomes明顯影響受體基質細胞內的miRNA成分，并且這一改變是通過抑制Axin1的表達和增加β-catenin蛋白以激活Wnt信號通路[17]。Exosomes來源于干細胞和成骨細胞前體能夠激活破骨細胞的形成。骨髓基質細胞來源的Exosomes已經被證實能夠影響破骨細胞前體至破骨細胞形成的過程。因此，該類Exosomes能夠被用在破骨細胞形成需要的組織中，例如正畸治療和雙膦酸鹽相關的關節骨壞死[21]。Huang等[22]評估了體內外牙髓細胞來源的Exosomes引起幼稚人牙髓干細胞及人骨髓基質細胞牙源性分化的可能。該結果證實Exosomes能夠被各種細胞內化，并且刺激牙分化所需基因的表達。更進一步，當檢測牙髓干細胞的齒根切片模型時，Exosomes能夠促進牙髓類似組織的再生[23]。Qi及其合作者利用干細胞來源的Exosomes去修復骨質疏松兔骨組織的缺損，證明Exosomes能夠有效刺激骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化，并且該作用隨著Exosomes濃度增加而增強。在體內Exosomes通過血管增生和骨生成以增強缺損的顱骨骨組織的再生。最近，人類胚胎間充質干細胞來源的Exosomes被用來治療兔骨軟骨缺陷[24]，第12周Exosomes處理后的缺陷展示出完整的軟骨和軟骨下骨，其表面光滑、具有完整形態。骨組織細胞來源的Exosomes能夠通過成骨細胞分化和破骨細胞的下調，以促進骨組織修復和再生。

5 骨組織Exosomes內miRNA的研究

骨組織來源的Exosomes miRNA能夠被用作成骨細胞分化和基質形成的靶點。有研究對骨形成過程中牽涉的Exosomes miRNA進行了分析。骨化細胞來源的Exosomes中的miRNAs中有4個是高表達的，即：miR-677-3p、miR-680、miR-3084-3p和miR-5000。Let-7蛋白在成骨細胞前體和分化成熟內Exosomes均可以被發現，并且能夠通過調控高遷移組蛋白AT-hook2(HMGA2)和軸蛋白2(Axin 2)增強骨的生成[14]。有報道表明骨轉錄因子(Runx2)被miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-199b、mir221和miR-133b-3p所調控，而 miR-30 d-5p和 miR-885-5p則負向調控成骨細胞的分化[25]。有研究證實破骨細胞來源的Exosomes miR-214-3p能夠抑制成骨細胞的骨形成。因此，抑制破骨細胞內miR-214-3p已經被當作是治療低骨量引起骨骼疾病的潛在的治療途徑[26]。

6 Exosomes在骨骼肌細胞分化再生、先天性肌病方面的角色

骨骼肌的代謝需要各種因子的平衡，包括分泌蛋白、炎性因子、miRNAs和脂膜類。肌母細胞能夠分泌Exosomes，增強肌肉的代謝。體外的幾項研究證實在C2C12細胞和人肌母細胞分化過程中，Exosomes的分泌增多[27]。肌母細胞分泌的Exosomes包含有各種生長因子，包括基礎成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長激素-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-B1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，具有調控生長、功能、修復的潛能[28]。用熒光標記法檢測Exosomes在肌母細胞胞質內的定位，發現肌母細胞不僅能夠分泌Exosomes，而且能夠內吞這些顆粒。肌小管分泌的Exosomes能夠通過cyclin-D1蛋白和myogenin蛋白促進肌母細胞的分化[24]。這些研究證實，肌細胞能夠分泌Exosomes，并且能被周圍或遠處的肌母細胞所內吞，影響其增殖和分化的能力。Exosomes同樣具有肌肉修復的作用。用肌肉來源的Exosomes處理受損的肌肉能夠降低肌肉的纖維化，增強再生肌纖維的數量[27]，且肌肉的損傷和鈣的內流能夠刺激Exosomes的釋放增多。進一步研究發現，Exosomes在肌肉的損傷修復過程中扮演信號交流分子的角色，其內包含的MiR-206能夠通過下調Twist-1蛋白促進肌母細胞的分化[29]。將肌母細胞與含有這些miRNA的Exosomes共同孵育，與直接與miRNA孵育產生的作用類似，能夠促進細胞的存活，降低細胞的死亡[30]。Exosomes在強直性肌營養不良癥(myotonic dystrophy、DM)也扮演一定角色[31]。DM病情進展的患者中的miR-1、miR-133a/b和 miR-206是升高的，而非進展的患者中該類miRNA沒有變化。研究發現這些miRNA能夠從Exosomes中分離獲得，并且可以隨著其他蛋白分子進行流通。因此，有設想管控這些Exosomes的分泌能夠間接調節這些miRNA的分布，從而影響病程的進展。

7 總結

以上這些研究都證實Exosomes通過作用于BMSCs、破骨細胞和成骨細胞在調控骨量代謝方面扮演著重要角色，且證實Exosomes在骨組織代謝的治療中存在很大的潛能。Exosomes的研究已經在腫瘤進展、標志物研究、干細胞產物方面取得了相當顯著的進展，而在骨組織方面研究相對較少。目前相關研究顯示骨骼相關的Exosomes對于骨組織的維持和修復具有重要作用。提取的骨組織內Exosomes有相當的生物活性，并且能夠調控骨組織的維持和修復。另外，關于Exosomes內的miRNA也進行了一些研究，發現miRNA調控許多關鍵的病理過程，并且提出針對Exosomes內miRNA進行調控能夠改善骨代謝。目前研究已經對不同組織來源的Exosomes的功能進行了探討，但在體內其是如何傳播和被捕獲，發揮調控的機制是什么，目前研究尚未深入。揭示骨組織中Exosomes發揮功能的作用過程，為治療骨代謝疾病提供新的策略是目前研究的重點。