水產(chǎn)動物腸道微生物的研究方法

郭倩倩，胡軍娜，魏金鎖，張 航

（1漯河市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南漯河462000；2漯河市源匯區(qū)農(nóng)林局，河南漯河462000；3漯河市植物保護植物檢疫站，河南漯河462000）

腸道微生物組成了生物個體內(nèi)部數(shù)量巨大且復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其組成及活性的變化與相關(guān)環(huán)境因素、宿主協(xié)同發(fā)展，與宿主相關(guān)基因組、營養(yǎng)吸收、代謝活動、生活方法形成了復(fù)雜的相互作用關(guān)系[1]。魚類體內(nèi)的腸道微生物在保持腸道健康、促使腸道發(fā)育、抵御病原入侵、改善機體能量吸收和脂肪代謝過程中起到了非常重要的作用。

本文就腸道微生物的影響因素、研究方法、尤其是目前最新最廣泛應(yīng)用的方法等作了綜述，以期為腸道微生物對魚類的影響，及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供全面的理論知識和應(yīng)用信息。

1 影響水產(chǎn)動物腸道微生物的因素

1.1 物種因素

多數(shù)研究表明，水產(chǎn)動物腸道微生物主要包括需氧微生物、兼性厭氧微生物和專性厭氧微生物。細菌是魚類腸道微生物最主要的種類。不同魚類腸道微生物的種類和比例不同。在一些魚類的腸道中，革蘭氏陰性細菌的數(shù)量居多，革蘭氏陽性細菌的數(shù)量較少。在海水魚類的腸道中，無色桿菌屬（Achromobacter）、微球菌屬（Micrococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、交替單胞菌屬（Alteromonas）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、黃桿菌屬（Flavobacterium）為主要的細菌類型[2]。在淡水魚類的腸道中，假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、擬桿菌屬A型（Bacteroidestype A）、氣單胞菌屬（Aeromonas）是首要的細菌類型。除此之外，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、梭狀桿菌屬（Clostridium）、微球菌屬（Micrococcus）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、鐮孢菌屬（Fusarium）和擬桿菌屬B型（Bacteroidestype B）在淡水魚類的腸道中也存在。此外，乳酸菌在淡水魚類和海水魚類腸道中均有發(fā)現(xiàn)。某些酵母菌也在魚類腸道中廣泛存在。在淡水魚類和海水魚類中均能發(fā)現(xiàn)紅酵母屬（Rhodotorula）中的酵母菌，并且發(fā)現(xiàn)的頻率較高。在海水魚類中，皮狀絲孢酵母（Trichosporoncutaneum）、假絲酵母菌（Candida tropicalisare）、梅奇酵母菌（Metschnikowiazobelii）是腸道酵母菌中的優(yōu)勢類群。

1.2 生理因素

魚類在生長發(fā)育的各種階段，其體內(nèi)腸道微生物的群落構(gòu)成比例及數(shù)量都不相同。在對歐洲鰨（Soleasolea）的研究發(fā)現(xiàn)，處在仔魚期的歐洲鰨腸道微生物以產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、莫拉克氏菌屬（Moraxella）、非產(chǎn)氣單胞菌屬（Anaerogenicaeromonas）為主，但在稚魚期和成魚期則主要以黃桿菌屬（Flavobacterium）、莫拉克氏菌屬（Moraxella）、發(fā)光細菌（Photobacterium）、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）、葡萄球菌 （Staphylococcus）、微非產(chǎn)氣單胞菌屬（Anaerogenicaeromonas）、弧菌屬 （Vibrio）、球菌（Micrococcus）為主。Verner-Jeffreys等對大西洋大比目魚（Hippoglossus hippoglossus）的研究也有相似的報道[2]。

1.3 環(huán)境因素

眾所周知，水體中含有大量的微生物，而魚類生活在水環(huán)境中。從仔魚孵化開始，微生物便以不同形式由水體進入腸道，其中適應(yīng)腸道內(nèi)環(huán)境的微生物便演變?yōu)槟c道中的常駐菌群。環(huán)境中的眾多因子影響魚類腸道微生物的組成和數(shù)量。季節(jié)的變化會引起魚類腸道微生物的變化。在對奧尼羅非魚（Oreochromisniloticus×Oreochromisaureus）腸道中細菌含量測定的研究中發(fā)現(xiàn)，在夏、秋、冬三個季節(jié)中腸道內(nèi)細菌數(shù)量的變化較大。水溫的高低也會影響魚類腸道微生物結(jié)構(gòu)組成[3]。Leamaster等[4]在紅羅非魚（Oreochromismossambicus）的研究中發(fā)現(xiàn)，水體溫度在18℃時，其腸道微生物的數(shù)量明顯多于26℃時。此外，水體中殘留的殺蟲劑、農(nóng)藥、抗生素等也會影響魚類腸道微生物菌群。

1.4 營養(yǎng)與飼料因素

飼料是促進魚類生長的最直接營養(yǎng)，它的組成成分會影響魚類腸道微生物的組成。研究表明，在仔魚階段、稚魚階段和幼魚階段，魚類體內(nèi)的腸道微生物菌群會根據(jù)飼料組成物質(zhì)和營養(yǎng)成分的改變發(fā)生相對較快的變化。飼料中添加相應(yīng)的添加劑（如益生菌或益生元等），將會對調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡狀態(tài)，改善腸道菌群構(gòu)成比例產(chǎn)生積極的作用。Ringφ等[5]研究表明，飼喂標準大豆蛋白和發(fā)酵大豆蛋白的大西洋鱈魚，魚體腸道中細菌以嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和肉桿菌屬（Carnobacterium）為主。而如果飼喂魚粉，魚體腸道中細菌則以肉桿菌屬（Carnobacterium）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）為主。

2 腸道微生物的研究方法

2.1 純培養(yǎng)方法

早期對人類腸道微生物的研究主要基于純培養(yǎng)研究方法，研究者通過模擬腸道內(nèi)厭氧環(huán)境，利用純培養(yǎng)技術(shù)，以糞便、腸粘膜或者腸道內(nèi)容物為研究對象，對腸道中的微生物類群進行定性定量分析鑒定。由于腸道內(nèi)存在的細菌種類較多，腸道內(nèi)環(huán)境中包含的營養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，且需嚴格厭氧條件，因此，用純培養(yǎng)方法來定性定量檢測腸道微生物菌群具有局限性，但獲得的純培養(yǎng)微生物對于幫助我們了解腸道微生物的結(jié)構(gòu)和功能意義重大。通過分離培養(yǎng)獲得腸道中微生物的純培養(yǎng)物，不僅有助于幫助我們研究腸道微生物在不同生長條件下的基因表達情況和代謝產(chǎn)物變化情況，更有助于幫助我們了解腸道微生物間的相互作用。此外，腸道微生物純培養(yǎng)還能夠為我們深入闡明致病菌的致病機理奠定基礎(chǔ)。

隨著分子生物學的發(fā)展，目前創(chuàng)建了“序列引導(dǎo)”分離方法，即首先利用分子技術(shù)對腸道菌群組成進行分析，之后根據(jù)分析結(jié)果選擇分離特定物種，通過基因組測序等方法，有針對性地對照分析腸道菌群與某些生理狀態(tài)相對應(yīng)的功能。

2.2 依賴指紋圖譜的分子生態(tài)學研究方法

基于純培養(yǎng)的微生物菌落結(jié)構(gòu)分析方法不能全面了解腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)、功能和多樣性。因為機體腸道內(nèi)嚴格的厭氧環(huán)境很難模擬，加上某些微生物需要的營養(yǎng)物質(zhì)較為特殊，絕大多數(shù)的腸道微生物菌株不能通過純培養(yǎng)方法分離得到。近幾年來，分子生態(tài)學發(fā)展迅速，與傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法不同，微生物分子生態(tài)學方法是針對群落當中所有DNA物質(zhì)進行分析，能夠較為全面地分析樣品中微生物群落組成和功能的多樣性。該方法無需進行純培養(yǎng)分離，速度相對較快，結(jié)果也較為客觀。

在微生物分子技術(shù)分析中，最為廣泛的分子標記物是核糖體小亞基RNA基因（16S rRNA或18S rRNA基因）。在微生物分子生態(tài)學應(yīng)用中，主要用于微生物群落組成結(jié)構(gòu)及物種多樣性分析，并對菌群功能進行預(yù)測。除此之外，利用特異性引物分析功能基因也是常用的方法。微生物分子生態(tài)學常用的技術(shù)主要有指紋圖譜技術(shù)和基于測序的技術(shù)。

指紋圖譜技術(shù)是通過PCR擴增獲得代表微生物群落的總體核酸分子，通過不同形式的凝膠電泳，分離不同核酸分子。該技術(shù)可以快速直觀地展現(xiàn)樣本中微生物群落的概況，適合同一樣本的動態(tài)監(jiān)測和不同樣本間的橫向比較。當前應(yīng)用較為廣泛的指紋圖譜技術(shù)主要包含了變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）、末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）和ERIC-PCR指紋圖譜。變性/溫度梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE/TGGE），是指擴增的片段長度一致但序列各異的雙鏈DNA分子在發(fā)生解鏈的變化過程中，所需的溫度或變性劑梯度不同。在電泳時，序列不一致的DNA會在遷移到不同的位置時發(fā)生解鏈，從而使不同序列的DNA分子在電泳過程中分開。Muyzer等首次利用變性梯度凝膠電泳研究微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性[6]。之后，研究學者將該技術(shù)應(yīng)用到人體腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究中[7]。隨后，張學禮等人對該技術(shù)進行了優(yōu)化，他們通過利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳去除由于PCR不完全造成的單鏈DNA污染，以此來提高變性/溫度梯度凝膠電泳圖譜的種類及對條帶回收測序的準確性[8]。末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）是通過限制性酶切特定片斷后，在片段末端加上熒光標記來區(qū)別不同物種的一種方法。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于土壤、水體、腸道菌群等復(fù)雜的環(huán)境微生物群落研究中。此外，PCR-ERIC指紋圖譜技術(shù)被應(yīng)用于環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的分析中。研究表明，針對不同的細菌類型，ERIC序列具有不同的數(shù)量以及長度，甚至在有的DNA中不需要ERIC序列的存在，使用ERIC-PCR引物也能夠進行PCR擴增，進而得到相對穩(wěn)定的指紋圖譜。鑒于該方法相對穩(wěn)定，獲得條帶的多態(tài)性較高，且操作簡單，因此常被用以鑒定不同細菌，反映群落結(jié)構(gòu)間的變化。

2.3 依賴測序的分子生態(tài)學研究方法

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，微生物結(jié)構(gòu)和功能的研究進入到一個革命性的時代。DNA測序技術(shù)可以直接獲取樣品中核酸物質(zhì)的序列信息，然后通過系統(tǒng)發(fā)育地位分析來判斷微生物群落組成的豐富度和多樣性，進而對各個物種的生物功能進行預(yù)測。微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究中比較常見的手段是16S rRNA基因克隆文庫，該技術(shù)利用克隆文庫獲得群落中每一條基因的系統(tǒng)發(fā)育地位，進而獲取微生物群落組成及多樣性的信息。Eckburg等人利用16S rRNA基因克隆文庫方法系統(tǒng)分析了腸道內(nèi)粘膜以及糞便中的微生物菌群組成，全面深入地闡明了腸道菌群結(jié)構(gòu)[9]。此外，某些專門針對腸道微生物特殊功能類群特異性克隆文庫的方法也隨之發(fā)展起來，如利用Clostridium leptum類群和Clostridium coccoides類群特異性的引物來構(gòu)建類群特異性的克隆文庫，分析腸道內(nèi)C.leptum類群和C.coccoides類群的多樣性[10，11]。

3 高通量測序在魚類腸道菌群研究中的應(yīng)用

當前，隨著國內(nèi)外高通量測序技術(shù)在人類及畜禽動物腸道微生物研究中的廣泛應(yīng)用，使用該技術(shù)研究魚類腸道微生物菌群組成也成為熱點。通過對高通量技術(shù)的使用，全方位認識對魚類體內(nèi)腸道微生物菌群組成比例的影響因素，對改善調(diào)節(jié)其消化道菌群組成、提高魚類的生產(chǎn)能力和飼料利用率、降低有害菌群對魚類的侵害起到十分重要的作用。李彤華等人采用454高通量測序技術(shù)對養(yǎng)殖于同一池塘的鯽魚 （Carassiuscuvieri）、草魚（Ctenopharynodonidellus）和鳙（Hypophthalmichthysnobilis）的腸道內(nèi)容物、腸上皮粘膜和相關(guān)環(huán)境樣品進行研究，分析樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)組成及多樣性。隨后通過Weighted-UniFra距離進行熱圖分析（Heatmap analysis）和主成分分析（Principal coordinate analysis），發(fā)現(xiàn)不同魚類的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)組成并非是對其生存環(huán)境中的微生物的簡單反映，而是來自腸道內(nèi)部微生物菌群特異性選擇壓力（尤其取決于種特異性的免疫和代謝）[12]。張皓等人利用高通量測序技術(shù)研究了鯉科魚（鰱、鳙、鯽、鯉、草魚、青魚）、南美白對蝦養(yǎng)殖池塘中水體、底泥及水產(chǎn)動物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的組成和多樣性，探究水體、底泥中的微生物群落與環(huán)境因子的互作關(guān)系。研究結(jié)果不僅加深了人們對養(yǎng)殖水體、底泥和水產(chǎn)動物腸道內(nèi)微生物群落間相互影響的理解，也為進一步從調(diào)控環(huán)境因子著手來改善養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)、抑制病原微生物、減少南美白對蝦和常規(guī)養(yǎng)殖魚類的傳染病發(fā)生提供理論依據(jù)。職通瑞利用16S rRNA測序技術(shù)，通過研究和分析凡納濱對蝦腸道內(nèi)的微生物群落，向人們揭示健康凡納濱對蝦腸道內(nèi)的微生物組成，闡明了美人魚發(fā)光桿菌（Litopenaeusvannamei）和對蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）對腸道內(nèi)微生物組成的影響，為人們更好地認識和使用微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。

4 小結(jié)

腸道微生物與魚類的生命活動具有非常緊密的關(guān)系。深入研究水產(chǎn)動物腸道微生物的組成、功能及作用機制，探究新的研究方法與思路，將為維持魚類腸道健康、提升水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖技術(shù)水平提供理論依據(jù)，為促進魚類的健康養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展奠定基礎(chǔ)。