“食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”改革案例
——傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離純化及分子生物學(xué)鑒定綜合性實(shí)驗(yàn)

吳海清 ，肖 萍 ，何新益 ，王 娜

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

“食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”作為食品專業(yè)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課，其實(shí)用性、技術(shù)性、應(yīng)用性極強(qiáng)[1]。對(duì)于食品科學(xué)類學(xué)生和食品領(lǐng)域的從業(yè)人員來(lái)說(shuō)，食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是必備的實(shí)驗(yàn)技能[2]，課程內(nèi)容一般分為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)、綜合性實(shí)驗(yàn)、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)3種類型[3]，其中綜合性實(shí)驗(yàn)是多個(gè)基礎(chǔ)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的連續(xù)開展，可提升學(xué)生實(shí)驗(yàn)的綜合處理能力[4]。為了提高學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)技能，提高學(xué)生設(shè)計(jì)、分析及解決實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)問(wèn)題的能力，課題組設(shè)計(jì)了“傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離、純化及分子生物學(xué)鑒定”綜合性實(shí)驗(yàn)的案例。通過(guò)2年的改革與實(shí)施，取得了良好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，為進(jìn)一步深化教學(xué)改革具有重要的參考價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理念

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，在“食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)”細(xì)菌學(xué)分離鑒定這部分實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，課題小組設(shè)立了“傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離、純化及分子生物學(xué)鑒定綜合性實(shí)驗(yàn)”，此實(shí)驗(yàn)包含材料采集、培養(yǎng)基的配置與滅菌、微生物的純種分離和培養(yǎng)、光學(xué)顯微鏡的操作和純培養(yǎng)菌種的形態(tài)觀察、微生物的染色、微生物的種類鑒定、菌種的保藏等環(huán)節(jié)。該實(shí)驗(yàn)具有很強(qiáng)的科研屬性，學(xué)生不僅要參與實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備，而且更需要用科研的思維來(lái)完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)，包括深入理解實(shí)驗(yàn)的目的和意義、查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、確定實(shí)驗(yàn)方法和步驟、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料、學(xué)習(xí)儀器的使用方法、配制實(shí)驗(yàn)所需試劑、撰寫預(yù)習(xí)報(bào)告和實(shí)驗(yàn)報(bào)告等。通過(guò)這一系列實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，訓(xùn)練學(xué)生從混雜的環(huán)境中分離、鑒定出單一菌株，并學(xué)會(huì)保藏菌種，鍛煉學(xué)生用理論知識(shí)指導(dǎo)實(shí)踐的能力，融合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)所學(xué)的操作技術(shù)，綜合運(yùn)用到實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中，進(jìn)一步鍛煉學(xué)生的團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力。為今后的大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練和畢業(yè)論文等教學(xué)實(shí)踐環(huán)節(jié)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[5-6]。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/h2>

了解乳酸菌的菌體形態(tài)和菌落特征形態(tài)，學(xué)習(xí)乳酸菌的分離原理，掌握乳酸菌的分離方法與操作技術(shù)，PCR擴(kuò)增基因的基本方法，掌握細(xì)菌傳統(tǒng)鑒定及16SrRNA分子鑒定的方法，并能熟練操作該項(xiàng)技術(shù)。該實(shí)驗(yàn)共9學(xué)時(shí)，每小組6～7人。

3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

（1）樣品。未成熟的醬醪、泡菜或酸乳等。

（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)備。鼓風(fēng)干燥箱、高壓蒸汽滅菌鍋、PCR儀、顯微鏡，電泳槽，電泳儀，PCR擴(kuò)增儀，高速冷凍離心機(jī)，凝膠成像儀、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱等。

（3） 試劑。溴甲酚綠（BCG） 牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基；基因組DNA提取試劑盒、2×Mixture、瓊脂糖、50×TAE、通用引物（27F和1492R）、革蘭氏染色試劑盒等；Gelred核酸染料、DNA Ladder（核酸Marker） 等。

（4）實(shí)驗(yàn)原理。采用分離鑒定培養(yǎng)基將檢樣中乳酸菌分離出來(lái)，得到純菌株，再進(jìn)行16SrRNA序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

（5）實(shí)驗(yàn)操作步驟。①培養(yǎng)基的配制：溴甲酚綠（BCG）牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基分別滅菌，無(wú)菌檢查合格后備用。②乳酸菌的分離：按照國(guó)標(biāo)的方法進(jìn)行無(wú)菌操作，接種于BCG培養(yǎng)基，于37℃下培養(yǎng)24～48 h，挑取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。③乳酸菌的純化：將革蘭氏染色為陽(yáng)性的乳桿菌分別接種于MRS、M17瓊脂培養(yǎng)基中連續(xù)傳代3次，鏡檢、菌落特征進(jìn)行純種鑒別。④乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定：模板DNA提取、16SrRNA基因擴(kuò)增、PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)均由學(xué)生獨(dú)立完成，PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。將測(cè)得的16S rDNA序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。⑤實(shí)驗(yàn)結(jié)果：分離出的乳酸菌菌落形態(tài)圖并加以描述，建立典型乳酸菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，乳酸菌的RAPD分型電泳圖。

4 實(shí)驗(yàn)考核方法

以前的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)考核更多的是注重實(shí)驗(yàn)報(bào)告上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，往往忽略了整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程。這種做法致使部分學(xué)生產(chǎn)生惰性心理，依賴同組的其他人，甚至?xí)霈F(xiàn)抄襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果的現(xiàn)象。對(duì)實(shí)驗(yàn)考核標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善和改革，考核內(nèi)容涵蓋了從實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方案實(shí)施、平時(shí)表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)報(bào)告到實(shí)驗(yàn)考試整個(gè)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)成績(jī)主要由實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)（10%）、方案實(shí)施（20%）、平時(shí)表現(xiàn)（20%）、解決問(wèn)題的創(chuàng)新能力（10%）、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（20%）、實(shí)驗(yàn)考試（20%）6個(gè)部分組成。

5 存在的問(wèn)題

因?yàn)榫C合性實(shí)驗(yàn)比傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)要復(fù)雜得多，不少學(xué)生曾流露出畏難情緒。為此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中指導(dǎo)教師花費(fèi)了大量心血，幫助學(xué)生順利完成從文獻(xiàn)查閱、實(shí)驗(yàn)方案制定到實(shí)驗(yàn)技能培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)和實(shí)驗(yàn)論文撰寫的各個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)。以前的食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一般安排為每位學(xué)生每周完成1次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室每周僅開放1次，極大地限制了學(xué)生實(shí)驗(yàn)的自主性。教學(xué)內(nèi)容改革后，要求學(xué)生應(yīng)根據(jù)本組實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程和需要，隨時(shí)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室完成實(shí)驗(yàn)。指導(dǎo)教師除了每周進(jìn)行集中講解和指導(dǎo)外，每天還抽出一定時(shí)間在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行針對(duì)性的指導(dǎo)和答疑。

6 學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)與反饋

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和要求，研究在2016和2017級(jí)食品科學(xué)與工程專業(yè)2個(gè)班級(jí)學(xué)生中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和評(píng)價(jià)，達(dá)到了較好的效果，獲得了很多寶貴的經(jīng)驗(yàn)。學(xué)生在實(shí)驗(yàn)報(bào)告總結(jié)中寫到：“通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)，對(duì)食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了濃厚的興趣，鞏固了微生物實(shí)驗(yàn)操作技能。”“通過(guò)實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)，加深了對(duì)微生物學(xué)理論知識(shí)的理解，并且經(jīng)過(guò)綜合性大實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練，學(xué)會(huì)了怎樣設(shè)計(jì)研究課題，熟悉了各個(gè)研究環(huán)節(jié)，學(xué)會(huì)了如何開展研究，為今后的畢業(yè)課題和走向工作崗位打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。”學(xué)生一致反映自己的食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作能力得到了有效的鍛煉，食品微生物學(xué)知識(shí)得到了進(jìn)一步升華，指導(dǎo)教師對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也非常滿意，獲得了學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)和教師的認(rèn)可與好評(píng)。

7 結(jié)語(yǔ)

該綜合性大實(shí)驗(yàn)，采用了以學(xué)生為主導(dǎo)、學(xué)生為中心的互動(dòng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式[7]，激發(fā)了學(xué)生的好奇心和學(xué)習(xí)興趣，極大地提高了學(xué)生的參與度，明顯提高了學(xué)生的綜合素質(zhì)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量，提升了教學(xué)團(tuán)隊(duì)的整體實(shí)力，使得學(xué)生不僅能夠掌握實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)知識(shí)、儀器操作方法，更重要的是在實(shí)踐中形成分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的習(xí)慣性思維能力。今后如何適應(yīng)社會(huì)發(fā)展的需求，培養(yǎng)高素質(zhì)創(chuàng)新型人才，仍需要不斷的思考、實(shí)踐和探索。