柴油機尾氣顆粒提取物對皮膚角質形成細胞蛋白組學的影響及抗氧化劑在皮膚健康中的作用

眾所周知，空氣污染威脅著人類的健康，而工業(yè)和車輛排放的廢氣是戶外空氣污染最主要的來源。柴油機排放物主要包括大小不同的碳質顆粒、脂肪烴、多環(huán)芳烴（PAH）及其衍生物、一氧化碳、硫和一氧化氮等氣體。柴油機尾氣顆粒物對人體造成有害影響的主要機制是誘導氧化應激，而氧化應激是導致皮膚外源性老化的一個重要因素。

除顆粒物外，柴油機尾氣還含有醛類、苯、1,3-丁二烯、PAH和硝基PAH等，也會對人體產生刺激的揮發(fā)性混合物。顆粒物表面會吸附40多種已知和300多種未知的PAH，占柴油機尾氣中揮發(fā)性成分的絕大多數(shù)。許多體內和體外研究已將PAH和活性氧（ROS）產物的細胞代謝與細胞毒性聯(lián)系了起來。有研究表明，柴油機尾氣和香煙煙霧中的PAH可以引發(fā)呼吸道炎癥反應。最近有研究還顯示PAH與UVA1協(xié)同作用來破壞皮膚角質形成細胞的內穩(wěn)態(tài)。盡管許多研究分析了柴油機尾氣中氣相組分的影響，但關注重點是PAH，缺乏對總氣相的無偏性研究。目前還沒有皮膚長期暴露于柴油機尾氣顆粒提取物（DPE）及其蒸氣下的高通量研究。

本研究旨在闡明長期暴露于柴油機尾氣對皮膚原代角質形成細胞（NHEK-Ad）的影響。采用定量蛋白組學的方法觀察角質形成細胞暴露于DPE或其蒸氣（DPE-V）時分子水平的改變，并進行基于質譜的蛋白組學分析，定量4 490個蛋白質。其中，在暴露于DPE和DPE-V相的角質形成細胞中分別發(fā)現(xiàn)有201個和374個蛋白質的表達變化均大于1.5倍（P≤0.05）。該研究表明，DPE及其蒸氣可顯著改變幾種蛋白的表達。據(jù)報道，這些蛋白參與維持皮膚上皮完整性，調節(jié)皮膚水合作用和氧化應激，同時維生素E處理能夠減輕DPE或其蒸氣對皮膚的不良影響。

一、材料和方法（詳見原文）

二、結果和討論

建立新細胞模型來研究長期暴露于DPE及DPE-V對人皮膚原代角質形成細胞的影響，作用后的細胞組分別為NHEK-Ad-DPE和NHEK-Ad-DPE-V。已知柴油機尾氣及其中的PAH和衍生物會增加ROS水平來影響細胞的信號轉導和氧化還原平衡。有研究證實，柴油機尾氣顆粒物可以產生ROS，引起氧化損傷并增加ROS的產生或蓄積，導致組織損傷。此外，ROS增加還會涉及包括老化和皮膚損傷在內的多種細胞過程。

1.長期暴露于DPE及DPE-V可誘導核因子紅細胞2相關因子2（NRF2）表達：為中和ROS的毒性作用，一些抗氧化蛋白和某些解毒酶，如NADPH醌氧化還原酶、γ谷氨酰胺半胱氨酸合成酶和血紅素氧合酶1，會通過抗氧化反應元件被轉錄因子激活。NRF2是負責抗氧化反應元件調控基因構成性和誘導性表達的轉錄因子。蛋白印跡結果顯示，NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中NRF2的表達相對于NHEK-Ad細胞有所增加。

2.DPE及其蒸氣暴露會導致角質形成細胞中普遍的蛋白組學改變：采用基于串聯(lián)質譜標簽（TMT）的定量蛋白組學方法研究長期暴露于DPE或DPE-V中的皮膚角質形成細胞內蛋白質組學的變化。共有4 490個蛋白質被定量和反復驗證，分別在NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中發(fā)現(xiàn)374個和201個蛋白質表達變化程度≥1.5倍（P≤0.05）。

兩組細胞中出現(xiàn)表達變化的蛋白包括角蛋白A、Suprabsin亞型1和抗白細胞蛋白酶。角蛋白A屬于SPRR蛋白家族，是一種參與角化過程的結構蛋白。抗白細胞蛋白酶或分泌性白細胞肽酶抑制劑是一種分泌抑制劑，可保護上皮組織免受絲氨酸蛋白酶的影響。

該研究還用DPE及DPE-V處理體外重建表皮模型EpiSkin（RHETM EpiSkinTM），數(shù)據(jù)重現(xiàn)了前面細胞體外培養(yǎng)所觀察到的蛋白組學結果。

正常角質形成細胞可以在支持增殖的培養(yǎng)基中生長。然而，暴露于DPE和DPE-V可導致一些參與細胞分化過程的蛋白表達變化。該研究采用生物信息學分析來闡明由于皮膚角質形成細胞慢性暴露于DPE或DPE-V中可能受到影響的生物過程。

3.暴露于DPE或DPE-V會影響與皮膚屏障功能及皮膚完整性相關的蛋白質：在兩組細胞中發(fā)現(xiàn)，多種具有皮膚生物學作用的蛋白均出現(xiàn)表達變化。兩組中均觀察到斑蛋白家族成員下調，包括周斑蛋白、包斑蛋白、外皮蛋白和epiplakin。斑蛋白家族是角質形成細胞中完成角質化上皮形成和維持上皮屏障完整性所必需的。兩組暴露條件的細胞內，維持上皮屏障完整性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑A、半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、sciellin、角蛋白A、角蛋白B和富含脯氨酸的小蛋白2D等蛋白均顯著下調。此外，在皮膚水合過程中起重要作用的絲聚蛋白也出現(xiàn)下調。

兩種損傷下，Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白家族的表達均明顯下調。Ⅱ型細胞骨架角蛋白80參與細胞分化，且對維持上皮細胞結構的完整是必需的，其表達在NHEK-Ad-DPE-V中下調了20%，在NHEK-Ad-DPE中下調50%。Ⅱ型細胞骨架角蛋白1（KRT1）和I型細胞骨架角蛋白10（KRT10）是角化過程中不可或缺的一對蛋白，賦予了細胞和整個表皮的機械完整性。KRT1-KRT10蛋白在兩種暴露下均出現(xiàn)下調。

4.DPE-V影響體外培養(yǎng)皮膚角質形成細胞的不同細胞過程：DPE-V由多種揮發(fā)性有機成分組成，會危害人皮膚，尤其是PAH及其衍生物，被認為可以通過線粒體ROS的產生和隨后的線粒體損傷來誘導皮膚外源性老化。蛋白質網絡分析顯示，NHEK-Ad-DPE-V表現(xiàn)出獨特的參與線粒體氧化磷酸化的相互作用蛋白簇。

（1）DPE-V暴露后線粒體氧化磷酸化蛋白的表達變化：蛋白質相互作用分析可以鑒定線粒體復合體I如NADH的蛋白組分，包括泛醌氧化還原酶亞基A7（NDUFA7）、NDUFA4、NDUFV2、NDUFS4、NDUFA2、NDUFS6、NDUFB7、NDUFS1，其過表達≥1.5倍（P≤0.05）。此外，在暴露于DPE-V的細胞中，線粒體復合物Ⅳ的組分包括細胞色素C氧化酶亞基7C（COX7C）、COX5B、COX6C、COX2、COX7A2、COX4I1、COX6B1以及泛醇-細胞色素C還原酶、復合物Ⅲ亞基X也過度表達（≥1.5倍，P≤0.05）。線粒體電子傳遞鏈復合物在ROS如超氧化物、過氧化氫和羥自由基產生中的作用已被廣泛證實。線粒體復合物Ⅰ可以形成電子進入氧化磷酸化的主要入口點，復合物Ⅰ和Ⅲ的活性增加可導致ROS的生成增加。總之，蛋白組學數(shù)據(jù)分析揭示了參與氧化磷酸化的線粒體蛋白表達變化，可能導致細胞內ROS增加，損傷皮膚。

（2）暴露于DPE-V對調控細胞遷移蛋白的影響：整合素是一種異二聚體的跨膜受體，參與了角質形成細胞遷移和傷口愈合。整合素α2β1已被證實是角質形成細胞遷移的必需因素。在傷口閉合過程中的遷移前沿和傷口愈合時新形成的表皮中，也已證實存在整合素α2β1的過表達。在NHEK-Ad-DPE-V中觀察到整合素β1（ITGB1）、ITGA2和ITGA3的顯著過度表達。除了整合素之外，在暴露于DPEV的細胞中還可以觀察到細胞外基質（ECM）蛋白如膠原蛋白α1（Ⅶ）（COL7A1）、COL17A1和COL18A1的過度表達。COL7A1參與角質形成細胞的黏附和p38MAPK依賴性遷移。COL17A1基因敲除還與角質形成細胞的移動減少有關。

基質金屬蛋白酶（MMP）是參與ECM蛋白轉化和降解的內肽酶。該研究的蛋白組學數(shù)據(jù)顯示，在NHEK-Ad-DPEV中，MMP14過度表達顯著，組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP2）則表達下調。MMP14介導的前MMP2活化已被證實在細胞遷移和上皮傷口愈合中具有重要作用。已知TIMP2可以特異性抑制MMP14介導的MMP2活化。有趣的是，參與細胞遷移的蛋白質似乎主要是在暴露于DPE-V的細胞中過表達，可能是細胞對DPE-V的防御反應。然而，在暴露于DPE的細胞中沒有觀察到這種細胞反應，這可能提示直接暴露于DPE對皮膚角質形成細胞的影響更強。

5.維生素E能部分修復角質形成細胞中由DPE及DPE-V導致的分子水平改變：用9 IU/ml維生素E處理暴露于DPE和DPE-V的細胞，暴露于DPE-V及DPE的細胞NRF2表達均降低。兩種暴露的細胞經維生素E處理后也會出現(xiàn)明顯聚集。蛋白組學分析顯示，維生素E處理可以使NHEKAd-DPE-V的374個表達發(fā)生變化的蛋白中約97%恢復至基礎水平。對于NHEK-Ad-DPE，維生素E處理能使201個表達發(fā)生變化的蛋白中約61%恢復至基礎水平。該結果表明，與暴露于DPE-V相比，直接暴露于DPE的作用更強。

維生素E處理可恢復參與皮膚角質層形成、脫屑、水合作用和結構完整性的蛋白表達水平，提示維生素E可減輕暴露于DPE和DPE-V對皮膚原代角質形成細胞的影響。維生素E處理還可以恢復暴露于DPE-V的細胞中線粒體復合物I和復合物IV的蛋白表達。表明維生素E等抗氧化劑對受DPE-V中氧化劑慢性影響的皮膚細胞具有保護功效。

觀察維生素E處理對NHEK-Ad-DPE-V遷移能力的影響發(fā)現(xiàn)，暴露組細胞的遷移率比對照組增加40%。因此，維生素E處理還可以部分恢復該影響。

6.角質形成細胞中DPE及DPE-V誘導的表達變化分子的鑒定和維生素E的恢復作用：研究者還在兩組細胞中發(fā)現(xiàn)了許多發(fā)生表達變化的新蛋白。在NHEK-Ad-DPE-V和NHEK-Ad-DPE中，核仁和螺旋體磷蛋白1及凋亡拮抗轉錄因子等蛋白過度表達。此外，兩組細胞均發(fā)現(xiàn)了非特異性細胞毒受體蛋白1同源物等蛋白下調。維生素E處理可以使兩種細胞的這些蛋白質水平恢復。該發(fā)現(xiàn)的生物學意義尚不清楚，還需進一步研究。

7.維生素E可以恢復暴露于DPE和DPE-V的細胞中涉及橋粒完整性蛋白的表達：暴露于DPE或DPE-V可以導致幾種與橋粒完整性有關的蛋白表達下調，如橋粒斑蛋白、斑菲素蛋白1和corneodesmosin。這些橋粒蛋白的突變或功能喪失與多種皮膚疾病有關。維生素E處理可以使DPE和DPE-V暴露細胞中這些蛋白的大多數(shù)恢復到近似未暴露的水平。接下來，了解這些蛋白質在皮膚生物學中的生物學意義會是有趣的工作。

總之，該蛋白組學研究強調了暴露于DPE和DPE-V所導致的分子變化的差異。直接暴露于DPE和DPE-V被證實可以改變參與維持皮膚完整性蛋白的表達水平。這些改變在體外重建皮膚模型中也得到重現(xiàn)。在DPE和DPE-V暴露細胞中，與細胞有絲分裂周期和染色體結構相關的蛋白表達也明顯改變。此外，DPE-V對線粒體氧化磷酸化和細胞遷移等生物學過程具有明顯的影響。使用抗氧化劑維生素E處理，還可以部分恢復DPE和DPE-V暴露細胞中發(fā)生改變的蛋白表達，這一發(fā)現(xiàn)強調了抗氧化劑在抵御空氣污染對皮膚損傷中的重要性。