禽大腸桿菌對慶大霉素的耐藥性誘導(dǎo)試驗(yàn)

王秀英

（遼寧省鐵嶺縣凡河動物衛(wèi)生監(jiān)督所 112600）

1 試驗(yàn)材料

1.1 微生物培養(yǎng)設(shè)備

恒溫箱、微生物接種用具、微量移液器、營養(yǎng)瓊脂、伊紅美蘭培養(yǎng)基、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、試管、童氏小管、溴甲酚紫試劑等。

1.2 試驗(yàn)菌種來源

來源于鐵嶺市種雞場近期未用藥自然發(fā)病雞的病料分離培養(yǎng)，經(jīng)生化試驗(yàn)和血清學(xué)檢查確定為致病性大腸桿菌，并在培養(yǎng)基中多次繼代培養(yǎng)。

1.3 藥敏紙片

自制藥敏紙片，每片含硫酸慶大霉素20μg[1]。

2 試驗(yàn)方法和步驟

2.1 試驗(yàn)菌種藥敏試驗(yàn)

采用K-B 法在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布法接種試驗(yàn)用大腸桿菌，置恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h，取出觀察結(jié)果，并進(jìn)行抑菌敏感性讀數(shù)。

2.2 確定最小慶大霉素抗菌濃度

根據(jù)大腸桿菌的耐藥產(chǎn)生機(jī)制，通過不斷適應(yīng)抗菌藥物環(huán)境，進(jìn)行耐藥誘導(dǎo)試驗(yàn)。操作方法如下。

（1）取試管8 支。分別乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)。第一支4.9ml，2～9 支4.5ml。

（2）倒置童氏小管，排出氣體，滴0.05%溴甲酚紫指示劑2 滴，高壓滅菌20min，備用。

（3）第1 支液體培養(yǎng)基中用微量移液器加入10%硫酸慶大霉素100μl，反復(fù)吹打混合均勻，即為慶大霉素2mg/ml 有效濃度，吸出500μl，加入第2 支培養(yǎng)基中，混合均勻，再吸出500μl 至第3 管，以此10 倍梯度稀釋有效濃度硫酸慶大霉素操作至第7 管，混合均勻，吸出500μl 丟棄不用。第8 去做對照。粘貼標(biāo)簽，標(biāo)記各試管中硫酸慶大霉素濃度。

（4）用微量移液器無菌操作向每只試管液體培養(yǎng)基中接種大腸桿菌菌液，搖勻。

（5）置恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h，取出觀察結(jié)果，觀察培養(yǎng)基色澤變化和童氏小管中氣體產(chǎn)生量，判定細(xì)菌是否生長。

2.3 大腸桿菌耐藥性誘導(dǎo)試驗(yàn)

（1）將耐藥誘導(dǎo)試驗(yàn)中略微開始生長的試管菌種繼續(xù)接種同一濃度乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，無藥乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基接種作空白對照。

（2）當(dāng)大腸桿菌逐漸適應(yīng)抗菌藥物環(huán)境生長良好或接近空白對照生長程度時，移接下一個10 倍梯度的慶大霉素乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，同時和空白培養(yǎng)對照。記錄繼代培養(yǎng)代數(shù)。

（3）大腸桿菌在某一濃度慶大霉素中適應(yīng)，產(chǎn)生耐藥，生長良好后，即可移接到下一個10 倍梯度的慶大霉素乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中，直到無法適應(yīng)，不再良好生長為止。記錄繼代培養(yǎng)代數(shù)和慶大霉素濃度。

（4）保留末代耐藥菌種進(jìn)行下一步試驗(yàn)，同時將末代菌種用K-B 法在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和抑菌敏感性讀數(shù)。

2.4 敏感性恢復(fù)試驗(yàn)

（1）末代耐藥大腸桿菌菌種移接至無藥的乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。每偶數(shù)代培養(yǎng)后進(jìn)行1 次K-B 法藥敏試驗(yàn)，分別移接至4lg 和3lg 慶大霉素乳糖膽鹽肉湯中培養(yǎng)，記錄繼代培養(yǎng)代數(shù)、生長情況和藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

（2）大腸桿菌對慶大霉素性不斷的恢復(fù)，至最大數(shù)據(jù)時停止試驗(yàn)，記錄恢復(fù)培養(yǎng)代數(shù)和最后恢復(fù)菌種的藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與分析

（1）慶大霉素最低抗菌濃度試驗(yàn)結(jié)果表明，在4log10 （以下簡寫lg）有效濃度時不能完全抑制大腸桿菌，即開始生長，慶大霉素對大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）為0.02μg/ml。

（2）耐藥誘導(dǎo)試驗(yàn)中，大腸桿菌在4lg 有效濃度慶大霉素中逐漸適應(yīng)產(chǎn)生藥性，在下一個10 倍梯度的慶大霉素環(huán)境中迅速適應(yīng)，繼續(xù)產(chǎn)生耐藥性，在2log10 有效濃度的慶大霉素環(huán)境中無法繼續(xù)適應(yīng)，耐藥性達(dá)到最大程度，耐藥性不再增強(qiáng)。大腸桿菌對慶大霉素敏感性明顯下降，由高敏變成低敏。

（3）根據(jù)耐藥誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果，將2lg 有效濃度的慶大霉素環(huán)境中大腸桿菌作為試驗(yàn)菌種進(jìn)行敏感性恢復(fù)試驗(yàn)。大腸桿菌在無藥的培養(yǎng)環(huán)境中對慶大霉素的敏感性開始緩慢恢復(fù)，之后迅速恢復(fù)，接近試驗(yàn)前的敏感程度。

（4）在無藥環(huán)境中對大腸桿菌繼代培養(yǎng)進(jìn)行敏感性恢復(fù)結(jié)果表明，初期大腸桿菌對慶大霉素的敏感性恢復(fù)緩慢，經(jīng)過一段時間后短時間即迅速恢復(fù)對慶大霉素的敏感性，由低敏恢復(fù)到高敏程度，幾乎接近初始狀態(tài)。

4 小結(jié)

（1）慶大霉素對大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）為0.02μg/ml，在防治用藥無效時可檢驗(yàn)體內(nèi)慶大霉素含量，其含量應(yīng)至少相當(dāng)于10 倍MIC，即0.2μg/ml 才能達(dá)到抗菌目的。

（2）大腸桿菌對慶大霉素容易產(chǎn)生耐藥性，一旦對慶大霉素適應(yīng)，迅速產(chǎn)生耐藥性。在無藥的情況下能很快恢復(fù)對慶大霉素的敏感性。因此，在臨床防治中不可長期使用慶大霉素，通常突擊性使用一個療程，以免產(chǎn)生耐藥，出現(xiàn)耐藥后停止應(yīng)用氨基糖苷類藥物一段時間即可恢復(fù)敏感性[2]。長遠(yuǎn)來看，慶大霉素仍然是治療大腸桿菌的一種有效藥物。