電場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的影響

劉小利 袁小燕

（長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院物理教研室，山西 長(zhǎng)治 046000）

軟骨是一種具有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的無(wú)血管組織，包含少量的軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞可保持ECM的完整性。軟骨組織受到損傷后，軟骨修復(fù)主要依賴于軟骨細(xì)胞的增殖、分化和ECM合成。如果在常規(guī)條件下體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，由于增殖能力較低，軟骨細(xì)胞在經(jīng)過(guò)一定的倍增后會(huì)逐漸喪失增殖能力而停止分裂。研究表明，軟骨細(xì)胞受到電刺激會(huì)影響細(xì)胞增殖，遷移和基因表達(dá)。但施加外電場(chǎng)時(shí)所需的電壓、頻率、波形等物理參數(shù)以及電場(chǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

1 電刺激裝置

電刺激場(chǎng)為直流電場(chǎng)或交流電場(chǎng)，可以是脈沖或連續(xù)形式的正弦波、鋸齒波或方波信號(hào)。這些信號(hào)可以由刺激芯片、信號(hào)發(fā)生器或其他儀器產(chǎn)生。電刺激方式為直接刺激或間接刺激。一般情況下，直接刺激是將正負(fù)電極直接插入培養(yǎng)皿中刺激細(xì)胞。間接刺激是以非侵入性的方式使用連接電源的外部平行電極，即在平行電極之間的培養(yǎng)基上施加電場(chǎng)，是一個(gè)電容耦合刺激系統(tǒng)[1]。

2 電場(chǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞的影響

電場(chǎng)在體外單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中的應(yīng)用已表明電場(chǎng)刺激可增加軟骨細(xì)胞數(shù)量并刺激合成復(fù)合軟骨的主要分子，如Ⅱ型膠原、糖胺聚糖（GAGs）和聚集蛋白聚糖。但是，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增值和相關(guān)分子的基因表達(dá)，需要設(shè)置合適的電刺激參數(shù)，如刺激時(shí)長(zhǎng)、電壓、占空比和頻率。

2.1 直流電場(chǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞的影響：有研究認(rèn)為，5 μA的直流電可刺激間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，并增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖[2]。直流電場(chǎng)還可影響軟骨細(xì)胞的遷移[3]，將直流電場(chǎng)作用于牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，電場(chǎng)強(qiáng)度大于0.8 V/cm時(shí)軟骨細(xì)胞有陰極遷移反應(yīng)，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度大于4 V/cm時(shí)，軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性的陰極遷移。但是，并不是所有的研究都認(rèn)為直流電場(chǎng)會(huì)對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生影響。Akanji等[4]將分離出的牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，接種于瓊脂糖結(jié)構(gòu)上，然后暴露在電流密度為4 mA/cm2的直流電場(chǎng)下6小時(shí)，結(jié)果表明，電流對(duì)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖、聚集蛋白聚糖和II型膠原mRNA表達(dá)無(wú)影響。雖然直流電場(chǎng)是提供電刺激的最簡(jiǎn)單方法，但是由于金屬電極的生物相容性較差，在電刺激細(xì)胞過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值的變化、分子氧水平降低等不良反應(yīng)，使得這種方法的使用受到了阻礙[5]，目前應(yīng)用較多的電刺激方式為電容耦合電場(chǎng)。

2.2 電容耦合電場(chǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞的影響：早在1978年就有研究發(fā)現(xiàn)電容耦合電場(chǎng)可促進(jìn)雞脛骨軟骨細(xì)胞DNA合成[6]。隨后，Brighton等[7]做了較詳細(xì)的研究，在頻率60 kHz的正弦波條件下，用不同電壓刺激牛膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞24 h，結(jié)果表明，10 V和1000 V的電壓抑制了細(xì)胞的增殖，而250 V的電壓則增加了GAGs的合成，但電場(chǎng)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。在以上的研究中，并沒(méi)有指明電刺激時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度的大小，Armstrong和Brighton 進(jìn)行了相關(guān)的研究。Armstrong[8]使用60 kHz的正弦波信號(hào)刺激牛生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞24 h，當(dāng)電壓為500、750、1000 V即電場(chǎng)強(qiáng)度為（1.5～3.0）×10-2 V/cm時(shí)，細(xì)胞增殖顯著；而電壓為1500 V即電場(chǎng)強(qiáng)度為4.5×10-2 V/cm時(shí)，電場(chǎng)則明顯抑制了軟骨細(xì)胞增殖。Brighton[9]用不同的電場(chǎng)刺激牛生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞，結(jié)果表明，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度分別為15、22.5、30 mV/cm時(shí)，軟骨細(xì)胞數(shù)量增加；當(dāng)電場(chǎng)為45 mV/cm，刺激后GAGs合成增加66%，從而可以認(rèn)為電場(chǎng)強(qiáng)度接近20 mV/cm時(shí)，電刺激可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增值。在接下來(lái)的研究中進(jìn)一步表明[10]，60 kHz正弦波、強(qiáng)度20 mV/cm的電場(chǎng)可使牛生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖增加47%。Wang等[11]在更詳細(xì)的研究中表明，20 mV/cm的電場(chǎng)在促進(jìn)軟骨細(xì)胞增值的同時(shí)，還可促進(jìn)聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的合成，但二者所需的最佳電刺激參數(shù)（如占空比和刺激時(shí)長(zhǎng)）并不相同，說(shuō)明在不同的電刺激條件下，軟骨細(xì)胞中大分子的基因表達(dá)上調(diào)具有一定的選擇性。然而，并不能認(rèn)為只有60 kHz、20 mV/cm的正弦波信號(hào)可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增值，Vaca-González等[12]用有限元方法分析計(jì)算電刺激系統(tǒng)中的電場(chǎng)強(qiáng)度，結(jié)果表明，在30 min內(nèi)施加4 mV/cm的電場(chǎng)時(shí)細(xì)胞數(shù)量增加；在5 h內(nèi)施加8 mV/cm的電場(chǎng)可維持穩(wěn)定的GAGs合成。有研究發(fā)現(xiàn)脈沖電場(chǎng)（PEF）和交變電場(chǎng)也可對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生影響。使用0.2 mV/cm的電容耦合脈沖電場(chǎng)刺激正常人軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞DNA含量在電刺激后72 h增加近150%[13]。用1 kHz，700 mV的交變電場(chǎng)刺激人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，基因表達(dá)分析表明，在低氧培養(yǎng)條件下，電場(chǎng)能增加人軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)；暴露于缺氧電場(chǎng)后，II型膠原合成顯著增加[14]。

3 電場(chǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞的影響機(jī)制

在電場(chǎng)作用于軟骨細(xì)胞的過(guò)程中，電信號(hào)影響軟骨細(xì)胞的具體機(jī)制仍不清楚[15]，可能涉及鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

Rodan等[6]認(rèn)為雞脛骨軟骨細(xì)胞增殖是由于細(xì)胞膜去極化引起的，外加電場(chǎng)促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的Na+和Ca2+流通進(jìn)而觸發(fā)了軟骨細(xì)胞的DNA合成。而B(niǎo)eit-Or等[16]在測(cè)定體外培養(yǎng)的雞骺軟骨細(xì)胞增殖分化的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，在軟骨細(xì)胞老化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量逐漸下降，認(rèn)為Ca2+濃度升高可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖。最早關(guān)于電壓依賴性鈣通道可能參與早期軟骨分化的研究發(fā)表于1989年[17]，其中L型鈣通道是細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)和生理活性起著重要作用。超微結(jié)構(gòu)研究證實(shí)了小鼠肢芽軟骨細(xì)胞中存在L型鈣通道[18]，Mancilla等[19]的研究也表明L型鈣通道存在于軟骨細(xì)胞中，并參與了軟骨細(xì)胞的增殖和分化。然而，Sanchez等[20]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化不受L型鈣通道阻滯劑（包括維拉帕米）的影響。為了進(jìn)一步闡明L型鈣通道在軟骨細(xì)胞中的作用，Xu等[21]用電容耦合的方式刺激牛髕骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，結(jié)果表明電刺激軟骨細(xì)胞主要對(duì)細(xì)胞膜施加影響，通過(guò)激活細(xì)胞膜中的電壓依賴性鈣通道，提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，導(dǎo)致細(xì)胞增殖增強(qiáng)、聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)上調(diào)，并對(duì)下游的鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)磷酸酶產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 語(yǔ)

對(duì)于電刺激軟骨細(xì)胞，不同的研究者使用的電場(chǎng)頻率、強(qiáng)度、刺激時(shí)間等參數(shù)各不相同，由于產(chǎn)生電場(chǎng)所需的電壓、達(dá)到最佳增殖速率和分子合成的刺激時(shí)間以及細(xì)胞培養(yǎng)所需的時(shí)間等限制因素，所得到的結(jié)果存在許多差異。電刺激軟骨細(xì)胞的確切作用機(jī)制也待進(jìn)一步闡明。因此，軟骨細(xì)胞電刺激在組織工程領(lǐng)域仍然需要更加深入的研究。