局灶性腦缺血動物模型的制備探究*

劉 勇 魏鑫甜 陳 伊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150036）

神經(jīng)系統(tǒng)疾病中以腦卒中較為嚴(yán)重，特別是缺血性腦卒中，因其較難控制的發(fā)病、致殘、致死性質(zhì)［1］，已然成為最嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，治療腦卒中的難點在于針對其發(fā)生的病理與生理學(xué)機制并提出合理的治療方案［2］。缺血性腦卒中的動物模型對于探究缺血性腦血管病的發(fā)生機理和治療預(yù)防非常重要［3］，腦缺血動物模型分為2類：彌漫型和局灶型。第一種由于對全身影響大，而且梗死區(qū)域不穩(wěn)定較難定位，故在研究中應(yīng)用不多［4-5］。第二種由于其可在特定腦區(qū)形成梗死灶并可進(jìn)一步研究再灌注損傷，而且對全身影響較小，較相仿于人類腦卒中，是探究缺血性腦卒中防治的先進(jìn)方法［6］。由于傳統(tǒng)腦缺血模型具有一定局限性，近年來研究者對傳統(tǒng)模型進(jìn)行改進(jìn)，力求高可重復(fù)性、高成功率、高易行性的新型模型，并已取得一定的進(jìn)展。

1 模型中動物的選擇

遵循探究目標(biāo)挑選最為適宜的動物，建立與人體腦卒中最為相仿的疾病模型對于研究腦缺血疾病發(fā)病機理和防治手段有著關(guān)鍵效用。盡管腦缺血模型與實際案例之間存在差異，但通過嚴(yán)格挑選與仔細(xì)斟酌，相似于人類腦卒中的動物模型［7］仍對科研及臨床發(fā)揮重大效用［7］。據(jù)相關(guān)研究表明［8］，局灶性腦缺血動物中，可選動物種類有非人靈長類動物、嚙齒類動物、非嚙齒類動物3大類。

1.1 選擇原則 原則為應(yīng)采取同人體解剖學(xué)構(gòu)造、生理學(xué)代謝及病理學(xué)特性等相仿的動物［7］。留意人體與模型對相同處理的差異，采用具有簡單結(jié)構(gòu)又能清楚反映試驗指標(biāo)的動物；選用動物為具有所研究疾病的近交動物或突變動物。在不影響實驗的情況下采用符合條件的標(biāo)準(zhǔn)化動物，且易取得性、經(jīng)濟(jì)性高者為佳。

1.2 實驗動物種類及優(yōu)缺點 非人靈長類：如狒狒和猴，其具有與人非常相仿的高級中樞發(fā)達(dá)程度，對藥物、機能、結(jié)構(gòu)、代謝等方面優(yōu)于其他哺乳類動物，但費用高、來源不易、飼養(yǎng)難［8］。豬：家豬的腦血管解剖構(gòu)造、血流代謝等方面同人體相仿，而且較少的側(cè)支循環(huán)適宜基礎(chǔ)方向研究［9］，但體型大，品系不純，并且由于豬豐富的腦動-靜脈吻合網(wǎng)而不利于建立穩(wěn)定可重復(fù)的腦梗死模型［10］。貓/狗：貓的神經(jīng)系統(tǒng)較發(fā)達(dá)，較易建立模型，但其腦解剖結(jié)構(gòu)與人腦區(qū)別較大［8］；狗的腦血管解剖結(jié)構(gòu)與人體區(qū)別顯著，而且具有豐富的頸內(nèi)外動脈吻合系統(tǒng)，不利于單動脈中斷法構(gòu)建穩(wěn)定的腦梗死灶［11］。家兔：大腦高級中樞發(fā)達(dá)程度不足，試驗結(jié)果不理想［12］。嚙齒類動物：包括沙土鼠和大鼠，其中大鼠經(jīng)濟(jì)性好、易獲得與飼養(yǎng)，為當(dāng)前模型動物首選。因基因與人類同源性高達(dá)98%，故具有相仿的血管結(jié)構(gòu)，血管性損傷部位實驗重復(fù)性好。并且種系內(nèi)基因純度優(yōu)，同系間基因遺傳穩(wěn)定，已成為實驗動物優(yōu)選方案［13］。

1.3 模型動物影響因素 所選動物的種類、品系、性別、體質(zhì)量、月齡、麻醉方法等均會對實驗產(chǎn)生影響［14］。種類：動物種類決定且腦結(jié)構(gòu)、血管生理特性不同，適合不同類型實驗。動物品系：同種動物的不同品系，在實驗變量完全相同時也可能產(chǎn)生不理想的試驗結(jié)局［14］。所以應(yīng)以實驗需求為先選擇原發(fā)性高血壓動物、繼發(fā)性高血壓動物、老齡組動物、糖尿病動物等。性別：雌激素的分泌對腦損傷有保護(hù)作用［15］，同種條件下雄性動物梗死體積較雌性大［16］，故多選擇雄性動物。體質(zhì)量：個體的重量對應(yīng)麻醉時及模型制備時藥劑及材料的使用量大小。月齡：同種動物不同月齡時血管解剖構(gòu)造具有進(jìn)行性的變化［17］。以大鼠為例，選擇壯年大鼠制備模型，腦梗死模型制備成功率較高，但腦缺血模型制備成功率不甚樂觀；選用老年大鼠制備模型，由于管腔不同程度迂曲、硬化、狹窄，反而產(chǎn)生新的變量，對實驗產(chǎn)生負(fù)面影響。麻醉方法：許多常用的麻醉劑會引起實驗動物一定程度的神經(jīng)保護(hù)［18］，故應(yīng)加入空白麻醉組以研究實驗動物的生理參數(shù)所受麻醉方法的影響。有文獻(xiàn)提出，常見于國內(nèi)實驗室的戊巴比妥鈉腹腔麻醉適于制作大鼠腦缺血模型，對Wistar大鼠產(chǎn)生極小試驗誤差［19］；而國外實驗室則多數(shù)采用氟烷等吸入麻醉法，在缺血后7 d內(nèi)動物生理參數(shù)可控率更高［20-21］。

2 傳統(tǒng)腦缺血模型的建立

傳統(tǒng)腦缺血模型的建立原理及方法已得到大多數(shù)實驗室及研究者公認(rèn)，雖然其造模方法成熟但仍囿于其局限性而僅限于特定領(lǐng)域。其中腦卒中患者情況以局灶性腦缺血較為符合，可采取大腦中動脈（MCA）中斷構(gòu)建局灶性腦缺血動物：永久性或暫時性動脈閉塞為兩種主要制備方式，具體制備方法有線栓法、血栓栓塞法、開顱物理閉塞法、開顱電凝法、光化學(xué)法等。

2.1 線栓法 線栓法由學(xué)者Koizumi發(fā)明，是當(dāng)前最廣泛開展的局灶性腦卒中造模術(shù)式，易于實施且多數(shù)無須開顱，故具有恢復(fù)快且對生理學(xué)誤差小。該法于頸部正中處切口，分離出右側(cè)四根動脈：頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）及翼腭動脈（PPA），結(jié)扎ECA和PPA，從CCA切口插入線栓，經(jīng)過ICA到達(dá)MCA起始端，結(jié)扎CCA近心端；血流再灌注研究時，由ECA放置線栓至MCA一端，移動線至ECA內(nèi)，便可構(gòu)建研究模型。目前研究者探究出改進(jìn)型術(shù)式如下［22］：在原有基礎(chǔ)上，不暴露PPA，阻斷ICA一步通過絲線懸掛完成。具體術(shù)式為盲插入線栓至0.5 cm，向下輕壓使其遠(yuǎn)端向上避開PPA開口，則線栓更順暢地進(jìn)入ICA。

2.2 血栓栓塞法 實際臨床中栓子可由動脈粥樣硬化、脈管炎、物理刺激等產(chǎn)生，沿循環(huán)系統(tǒng)在局部腦血管產(chǎn)生阻塞引起病變。學(xué)者Kudo等發(fā)明此模型建立方法［23］，其優(yōu)勢在于可誘發(fā)更符合實際的病理性自體栓塞，栓塞部位符合病理且缺血部位合理；而且對于栓塞的治療—溶栓研究方面可提供極大的便利。但其也存在相應(yīng)不足之處：栓塊運行路徑不可控和無法栓塞特定血管。鑒于導(dǎo)管處生成栓塊后，栓塊隨循環(huán)系統(tǒng)運行路程長，故存在較大不確定性與較低可重復(fù)性，對試驗產(chǎn)生相應(yīng)誤差。栓塞法制備方法可以確定栓塊的來源與具體成分；但存在栓子的體積、走行路徑和最后滯留位置的不確定性，栓塊能否成功阻塞目標(biāo)血管等問題。再者由于實驗動物腦的側(cè)支循環(huán)形成不可控的實驗誤差，使此方法有礙于神經(jīng)疾病癥狀的研究和病變灶的定性定量分析。于是，在后繼研究者們的努力下，例如學(xué)者沈順姬等采取尾靜脈血，制取直徑0.3 mm，長4 mm栓塊于顯微導(dǎo)管中，行顯微注射技術(shù)從ECA反向至ICA相匯部位，注射進(jìn)ICA從而制備大鼠腦缺血模型，梗死部位恒定，可重復(fù)性好［24］。2012年學(xué)者Durand等在栓塞法基礎(chǔ)上，于顳葉處行顯微注射，導(dǎo)入凝血酶于MCA內(nèi)，造成MCA原位血栓，再配合溶栓方案，開啟血栓栓塞-溶栓這一新的研究領(lǐng)域［25］。

2.3 開顱物理閉塞法 由Tamura等首先建立并后繼研究者不斷改進(jìn)［26］。本術(shù)式由顳下部或眼眶部開顱，目標(biāo)血管為MCA及分支血管，阻斷后可形成腦卒中灶。本術(shù)式優(yōu)勢為可視性高，與線栓法對比，無論術(shù)后缺血效果、術(shù)后生存時間（多達(dá)14 d或更多）與神經(jīng)功能評分均優(yōu)于后者［27］。另有學(xué)者采取圈套器等工具，通過對MCA的捆扎壓迫與松解恢復(fù)，實現(xiàn)局灶性供血中斷與再通。該法常用于貓及靈長類動物的研究。該術(shù)式局限性為難度偏高，術(shù)者易操作不當(dāng)引起大量出血導(dǎo)致實驗失敗，并且閉塞MCA過程不可逆，因此本方法不能大量施行。后來經(jīng)研究者改進(jìn)方案后可行性增加，如學(xué)者金榮等選取顯微夾閉法，中斷一側(cè)MCA和雙側(cè)CCA制備缺血模型并再通以研究相應(yīng)溶栓藥物的療效［28-29］。學(xué)者Kaplan等采用微小金屬鉤壓迫MCA并可再通，亦不失為另一種可行方案［29］。

2.4 開顱電凝法 該方法通過開顱手術(shù)暴露大腦中動脈，然后用電極灼燒大腦中動脈相應(yīng)部位使血管閉塞，引起大腦中動脈供應(yīng)區(qū)皮質(zhì)及相應(yīng)皮質(zhì)下區(qū)域梗死。該方法具有可視性強、梗死灶形成時間短，以及梗死部位一定程度可控的優(yōu)點，但因需開顱故對術(shù)者要求高，損傷大且有顱內(nèi)感染風(fēng)險，并且只能誘導(dǎo)永久性閉塞。在2013年由Yang等改進(jìn)，對其左側(cè)MCA采取電凝封閉，再中斷雙側(cè)ICA血流15 min以建立模型［30］。同時多次試驗表明氟烷吸入法對小鼠神經(jīng)保護(hù)作用較好。該術(shù)式優(yōu)勢為操作快、失血少因而成功率高［31］，能夠有效評價模型動物中、遠(yuǎn)期神經(jīng)功能。

2.5 光化學(xué)法 由靜脈，例如大鼠尾靜脈導(dǎo)入光敏誘導(dǎo)劑，如常見誘導(dǎo)劑玫瑰紅可由定波冷光源（560 nm）激發(fā)后，催化局部組織形成單氧自由基，而后者可令脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致栓子形成并停留于血管內(nèi)繼而令血管阻塞中斷［32］。由于光線透過顱骨時與血管內(nèi)光敏誘導(dǎo)劑接觸發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，故該造模方法可令靶血管供應(yīng)區(qū)產(chǎn)生病灶并可量化記錄，同時梗死灶大小與冷光源的強度、時長和光敏誘導(dǎo)劑的種類、劑量相關(guān)。若需MCAO模型動物，可直接在術(shù)中顯現(xiàn)的MCA中注射光敏誘導(dǎo)劑，于特定光源激發(fā)下并可在鏡下觀察血栓［14］。該術(shù)式易引起早期血腦屏障開放，并有可能造成較嚴(yán)重的微血管損害即血管源性腦水腫，此法雖有助于抗血小板和溶栓藥物研究，但并不是完全模擬人體的動物模型［33］。而Yang等改進(jìn)后的方案采用伊文思藍(lán)作為光誘導(dǎo)劑，可見梗死區(qū)血腦屏障的破壞及神經(jīng)細(xì)胞的皺縮壞死，更加有力反映局灶性腦梗死的病變進(jìn)程［34］。

3 新型腦缺血模型的建立

以往的腦卒中動物模型在不同研究中逐漸顯現(xiàn)出不足之處，因而研究者更需求高生存率、高可重復(fù)性的先進(jìn)建模術(shù)式。主要制備方法有：內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)法；局部FeCl3化學(xué)誘導(dǎo)法；原位注射凝血酶；球囊導(dǎo)管法；皮層壓迫法；CCA加壓夾閉法；皮層壓迫法；內(nèi)膜損傷法等。還可選用轉(zhuǎn)基因模型動物和基因敲除動物。

3.1 內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)法 內(nèi)皮素-1作為較強的內(nèi)源性因子可引起靶血管收縮而血流量減少，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可產(chǎn)生持久性的局部腦血流量減少并促進(jìn)腦梗死，還可同時損傷神經(jīng)元和相應(yīng)區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞造成缺血灶。學(xué)者M(jìn)acrae等于MCA近端應(yīng)用血管活性物質(zhì)，引起相應(yīng)區(qū)域血供不足并產(chǎn)生缺血灶，多次實驗證實缺血灶大小與劑量正相關(guān)，并伴有少量的再灌注現(xiàn)象［35］；學(xué)者Fuxe等注射誘導(dǎo)劑于一側(cè)紋狀體中，可誘發(fā)卒中灶和半暗帶［36］。該誘導(dǎo)法對以往手術(shù)方法優(yōu)勢在于僅有細(xì)微的機械損傷，并可通過誘導(dǎo)劑用量來定量影響供血中斷和恢復(fù)時長［37］。由于其可令實驗動物意識清醒，還可用于驗證與評價神經(jīng)保護(hù)劑的效果。

3.2 局部FeCl3化學(xué)誘導(dǎo)法 由于傳統(tǒng)的顯微操作難以制備近端血供中斷模型，而且可能誘發(fā)硬腦膜及動脈周圍皮質(zhì)損傷，故有學(xué)者提出改進(jìn)意見：利用化學(xué)誘導(dǎo)劑局部注射入MCA以構(gòu)建模型。該術(shù)式可在動脈處產(chǎn)生局部血栓，具體方法為采取FeCl3等化學(xué)誘導(dǎo)劑局部浸潤動脈內(nèi)壁，在化學(xué)刺激下引起內(nèi)膜剝脫與組織變性，繼而誘發(fā)動脈內(nèi)血栓［38］。學(xué)者劉小光等行開顱手術(shù)令特定段MCA（大腦下靜脈和嗅束之間）顯現(xiàn)于術(shù)野內(nèi)，覆蓋以帶有FeCl3誘導(dǎo)劑濾紙條，操作后1 d內(nèi)可形成缺血灶，病理學(xué)檢查可見由混合血栓引起［39］。該方法易于顯微操作，對硬腦膜和動脈周圍皮質(zhì)的損傷減小、死亡率低，但利用t-PA進(jìn)行溶栓治療研究時敏感性不足，不適合用于神經(jīng)保護(hù)藥物的研究。

3.3 原位注射凝血酶 由于傳統(tǒng)血栓栓塞模型的血栓定位性較差，血凝塊位置差異較大，并且不適宜在顯微鏡下操作及實時監(jiān)測。近年來有學(xué)者指出可通過原位注射凝血酶誘導(dǎo)，從而定量確定梗死灶位置、大小，還可一定程度上提升可重復(fù)性［40］。具體可采取開顱顯現(xiàn)MCA分支處，用微量吸管注射法致血凝塊形成。該方法顯微鏡下可直視操作、死亡率低，并與rt-PA聯(lián)動可探究溶栓藥物作用［40-41］。但存在開顱手術(shù)的損傷風(fēng)險及血凝塊破裂誘發(fā)微小栓塞的可能。

3.4 新型改進(jìn)術(shù)式 球囊導(dǎo)管法：作為原有線栓法的新術(shù)式，學(xué)者Hamberg等采用股動脈放置導(dǎo)絲，經(jīng)導(dǎo)絲導(dǎo)引下球囊導(dǎo)管經(jīng)升主動脈、CCA，最后由ICA入顱，經(jīng)由控制MCA球囊大小來控制血供的中斷與再通［42］。學(xué)者Jungreis等對上述方法加以創(chuàng)新，采取用導(dǎo)絲不可逆性中斷MCA和用球囊可逆性中斷ICA，構(gòu)成腦梗死改變［43］。 CCA 加壓夾閉法：學(xué)者 Nishimura 等［44］首創(chuàng)此法：采取沙土鼠為模型動物，于頸正中行術(shù)式，顯現(xiàn)CCA后，利用具有彈性的聚乙烯管壓迫CCA并造成物理損傷。進(jìn)而具有局部血栓出現(xiàn)快，實驗可重復(fù)性高的優(yōu)點皮層壓迫法：該方法采取激光多普勒探頭。該術(shù)式需定位初級軀體感覺皮質(zhì)，在所在骨性標(biāo)志鉆孔，在保證硬腦膜不受損的情況下，用帶有激光多普勒探頭的金屬柱對硬腦膜造成物理損傷，形成局部缺血區(qū)域［45］。

3.5 內(nèi)膜損傷法 分為負(fù)電流和誘導(dǎo)劑損傷法［41］。負(fù)電流電解損傷法：將負(fù)電極置入血管內(nèi)皮，需確認(rèn)電極不絕緣并緊密連接內(nèi)皮細(xì)胞，采取雙道方波產(chǎn)生器發(fā)起刺激損傷內(nèi)皮細(xì)胞，形成阻塞血管腔的血栓，影響血供從而誘發(fā)卒中灶。誘導(dǎo)劑法：通過誘導(dǎo)劑刺激局部血管作用，血管內(nèi)皮病理生理變化同負(fù)電流損傷法。

3.6 轉(zhuǎn)基因動物和基因敲除動物的應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因動物和基因敲除動物的應(yīng)用，可為小鼠腦DIC時細(xì)胞損傷及神經(jīng)保護(hù)機制中相關(guān)基因表達(dá)的研究引發(fā)新思路。其他造模方法也可用于該模型動物。本文中不做贅述。

4 局灶性腦缺血模型的不足與展望

以上文中介紹基本局灶性腦缺血動物的制備方法與影響因素，但由于疾病的綜合性與患者狀況的復(fù)雜性，通用型動物模型的建立顯然不切實際，具體情況下我們作為研究者需要一種綜合化立體化的考量。對于患者并發(fā)癥的處理：基礎(chǔ)實驗最終是服務(wù)于臨床的，而在臨床診斷治療中，往往患者伴有一種或多種并發(fā)癥，作為研究者需注意此點。如高血壓品系和糖尿病品系實驗動物的應(yīng)用可以模擬病情的復(fù)雜性，這有利于評估新型治療方法與開發(fā)新型腦卒中藥物。對于不同生理參數(shù)的處理：不同生理狀況時，動物對疾病與藥物的反饋具有一定差異，如血流量與體溫等。研究表明皮質(zhì)血流過速時易導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血，而溫度下降對于神經(jīng)外科手術(shù)的幫助也有目共睹。實驗研究中不能控制的生理參數(shù)變量也會影響實驗結(jié)果，而這些變量有些作為誤差，有些卻是未來可行的治療機制。

目前大多數(shù)動物局灶性腦缺血模型具有局限性，只能模擬腦卒中機理的一個或數(shù)個方面，這也是本領(lǐng)域基礎(chǔ)研究難以轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的主要原因。作為研究者應(yīng)選擇適合研究方向的動物模型，并積極控制模型變量，及時發(fā)現(xiàn)模型不足并改進(jìn)，力爭為腦卒中的研究帶來突破，為患者謀求生命質(zhì)量。