基于“肺腸理論”和膽汁酸代謝網(wǎng)絡(luò)探討定喘湯對(duì)呼吸道合胞病毒感染大鼠腸道菌群調(diào)節(jié)的研究

崔振澤， 徐超， 遲磊

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytical virus,RSV)感染是引起嬰幼兒時(shí)期毛細(xì)支氣管炎的最常見(jiàn)病原，發(fā)病率較高，且相當(dāng)多患兒未來(lái)會(huì)發(fā)展至支氣管哮喘，嚴(yán)重危害兒童健康[1]，其臨床癥狀除表現(xiàn)為典型的咳嗽、氣促外，還會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉或便秘等胃腸道反應(yīng)。有多種文獻(xiàn)報(bào)道，呼吸道病毒侵害機(jī)體后，均可導(dǎo)致腸道組織發(fā)生病理改變[2-3]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)早已有言“肺與大腸相表里”，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也發(fā)現(xiàn)呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)兩大黏膜器官之間有著密切關(guān)系[4]。所以說(shuō)，無(wú)論是中醫(yī)還是西醫(yī)都已經(jīng)深刻認(rèn)識(shí)到肺部感染可能導(dǎo)致腸道損傷，也可能進(jìn)一步影響了腸道菌群的變化。而已知RSV感染患兒常伴有大便性狀和(或)次數(shù)改變，但是否會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)尚不得而知，亦未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

代謝組學(xué)可以從代謝終端產(chǎn)物的角度整體性和系統(tǒng)性地闡釋中醫(yī)證的實(shí)質(zhì)及中藥復(fù)方的藥效與作用機(jī)制。且前期的研究中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自《攝生眾妙方》的定喘湯不僅可以抑制RSV病毒復(fù)制，而且還可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫平衡來(lái)達(dá)到止咳平喘的功效[5]。本研究建立RSV感染大鼠肺炎模型，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)分析正常對(duì)照組、RSV模型組和藥物干預(yù)組大鼠血清中代謝物的相對(duì)含量變化，以初步闡釋定喘湯調(diào)節(jié)RSV感染大鼠后機(jī)體膽汁酸代謝及腸道菌群的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病毒 RSV Long株，來(lái)源于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室，凍存于-80 ℃冰箱備用。測(cè)定大鼠RSV病毒半數(shù)致死量LD50為1×10-2/mL。

1.2 動(dòng)物 健康3周齡左右的SPF級(jí)Wistar大鼠27只，雌雄各半，體質(zhì)量均為(30±10)g，由遼寧本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001]。

1.3 藥物 參照《攝生種妙方》，定喘湯組由麻黃、杏仁、半夏、桑白皮、白果、款冬花各9 g，蘇子6 g，黃芩12 g，甘草3 g組成，以上藥物均購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局。

1.4 試劑與儀器 Realtime PCR試劑盒(DRR047A，DRR820A，TaKaRa寶生物工程有限公司)；乙腈(Merck,Germany)；甲酸(Sigma-Aldrich,USA)；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)由MilliQ系統(tǒng)制備(Millipore，USA)。7500Real Time PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems)；Nano2000型超微量紫外分光光度計(jì)、低速冷凍離心機(jī)(美國(guó)，Thermo)；電泳儀(DYY-10C)；MicroChemi 4.2化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)；ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)(Waters，USA)；Waters ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)(Waters，USA)；AB triple TOFTM 5600質(zhì)譜(Applied Biosystems，USA)。

1.5 方法

1.5.1 定喘湯的制備 10倍量水浸泡30 min，煎煮90 min，趁熱過(guò)濾；第2次用8倍量水煎煮60 min。合并2次濾液，再濃縮后制成含生藥2 g/mL的藥液備用。

1.5.2 造模、給藥和模型評(píng)價(jià) 采用病毒液滴鼻法建立大鼠RSV感染模型。將Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即正常組、RSV模型組和定喘湯組，每組9只。除正常組外，其余各組在乙醚麻醉下經(jīng)鼻腔接種RSV Long株病毒液，0.1 mL/只，正常組在同等條件下接種等量不含病毒的生理鹽水，每日1次，連續(xù)接種3 d。各組在RSV Long株病毒液滴鼻2 h后開(kāi)始灌胃，定喘湯組給藥劑量相當(dāng)于60 kg成人臨床等效量，正常組與RSV模型組均予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次(人與大鼠等效劑量公式為：大鼠的劑量=6.3X mg/kg)。

模型評(píng)價(jià)分為一般行為觀察和病理改變兩方面。特征指標(biāo)測(cè)定包括：(1)肺指數(shù)：各組大鼠分別于感染第7天，于無(wú)菌條件下取肺組織，稱(chēng)各組大鼠肺臟重量，計(jì)算肺指數(shù)。肺指數(shù)=肺臟重量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。(2)病理切片：取新鮮大鼠肺組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色等處理，中性樹(shù)膠封固，觀察各組大鼠肺組織炎癥變化情況。

1.5.3 樣品的采集和處理 正常組、RSV模型組及定喘湯組大鼠分別于感染第3天，摘眼球取血，將血置于血清分離管中，放置2 h，3 000 r/min離心15 min，收集血清，后置于-80 ℃冰箱內(nèi)凍存。

測(cè)定前，取血清，室溫解凍，8 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，加入400 μL純水，渦旋1 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液即可。

1.5.4 LC-MS代謝組學(xué)分析 液相條件：色譜分離系統(tǒng)采用Waters ACQUITY超高效液相色譜(UHPLC)(Waters，USA)。采用ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫60 ℃，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈。洗脫梯度：5% B保持0.5 min，2 min時(shí)線(xiàn)性升至60% B，8 min時(shí)線(xiàn)性升至100% B，保持2 min，0.1 min內(nèi)回到初始比例5% B以平衡色譜柱，總分析時(shí)長(zhǎng)12 min。流動(dòng)相流速為0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：使用AB triple TOFTM 5600質(zhì)譜(Applied Biosystems,USA)作為檢測(cè)系統(tǒng)。霧化氣流流速：55 psi；輔助加熱氣流流速：55 psi；氣簾氣流速：35 ps；一級(jí)掃描范圍m/z 80～1 000 Da，碰撞電壓10 V；二級(jí)掃描范圍m/z 60～1 000 Da，碰撞電壓40 V；正離子噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度550 ℃；負(fù)離子噴霧電壓4.5 kV，離子源溫度450 ℃。

2 結(jié)果

2.1 定喘湯干預(yù)RSV感染大鼠的效應(yīng)評(píng)價(jià)

2.1.1 一般行為觀察 RSV感染大鼠后的第3天，與正常組相比，大鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)度、皮毛狀態(tài)等一般情況發(fā)生了較差的變化；應(yīng)用定喘湯干預(yù)后，大鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)度、皮毛狀態(tài)等一般情況明顯好轉(zhuǎn)，見(jiàn)表1。

表1 定喘湯對(duì)RSV感染大鼠一般狀態(tài)的影響

2.1.2 特征指標(biāo)測(cè)定

2.1.2.1 肺指數(shù) RSV感染組大鼠第3天的肺指數(shù)明顯增加，與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與RSV感染組比較，定喘湯組大鼠的肺指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 定喘湯對(duì)RSV感染大鼠肺指數(shù)的影響

注：與正常組比較，aP<0.05；與RSV模型組比較，bP<0.05。

2.1.2.2 病理變化 見(jiàn)表3和圖1(見(jiàn)封三)。

2.2 定喘湯干預(yù)RSV感染大鼠血清中代謝物譜分析 PCA能從總體上反應(yīng)各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小，其可以對(duì)原始數(shù)據(jù)樣品分布進(jìn)行總體呈現(xiàn)，考察定喘湯干預(yù)RSV感染大鼠后血清中代謝物變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖所示，正常組、RSV模型組與定喘湯組的血清樣本在PCA得分圖中完全分離，說(shuō)明3組的血清代謝物譜有明顯的差異，定喘湯可能影響RSV感染大鼠血清中的代謝物，從而對(duì)其體內(nèi)的代謝紊亂進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖2 3組大鼠血清代謝產(chǎn)物散點(diǎn)分布圖

2.3 定喘湯對(duì)RSV感染大鼠血清中相關(guān)代謝標(biāo)志物的影響 與正常組大鼠比較，RSV感染組大鼠血清中檸檬酸(CA)、牛磺膽酸(TCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、7-酮基脫氧膽酸(7-ketodeoxycholic acid)及苯乙酸(Phenylacetic acid)水平顯著升高，甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與RSV模型組比較，定喘湯組大鼠血清中檸檬酸(CA)、牛磺膽酸(TCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、7-酮基脫氧膽酸(7-ketodeoxycholic acid)及苯乙酸(Phenylacetic acid)均有所回調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 定喘湯對(duì)RSV感染大鼠病理變化的影響

表4 定喘湯對(duì)RSV感染大鼠血清中代謝產(chǎn)物的影響

注：與正常組比較，aP<0.05；和模型組比較，bP<0.05。

3 討論

在中醫(yī)理論中，“肺與大腸相表里”不僅僅是指肺與大腸的里外深淺等解剖位置，更是以臟腑、氣化和經(jīng)絡(luò)為基礎(chǔ)，來(lái)詮釋肺和大腸兩者病理生理關(guān)系。如《素問(wèn)·咳論》云：“肺咳不已，則大腸受之；大腸咳狀，咳而遺矢”；又如《癥因脈治泄瀉論》云：“又有痰積在肺肺移于大腸清肺經(jīng)之痰則大腸之瀉自止”，均闡釋了若肺的生理功能運(yùn)行失常，則易下遺至大腸。臨床實(shí)踐也充分證明了這一點(diǎn)，患兒如出現(xiàn)咳嗽、氣促及喘息等癥狀，往往也會(huì)合并腹脹、便秘、腹瀉等，且預(yù)后往往較差。許多中醫(yī)名家已把“肺腸理論“運(yùn)用到臨床實(shí)踐中多年，療效顯著[6-7]，而定喘湯在治療毛細(xì)等喘息類(lèi)疾病伴惡心、嘔吐、腹瀉癥狀出現(xiàn)時(shí)效果也頗為不錯(cuò)。定喘湯立方旨在宣升開(kāi)肺，降逆平喘、清熱化痰，方中以麻黃、黃芩、桑白皮宣發(fā)風(fēng)熱、驅(qū)邪外出，以白果、款冬花、半夏、蘇子、杏仁、甘草降氣化痰，止咳平喘。本方宣升與清降并用，發(fā)散與收斂兼施，從多個(gè)方面體現(xiàn)其藥理作用，使氣機(jī)升散有度，降泄得宜，可充分發(fā)揮化痰平喘的功效。不僅如此，RSV感染患兒出現(xiàn)的惡心、嘔吐、腹瀉或便秘等胃腸道癥狀通過(guò)此方也得到了緩解，無(wú)論患兒肺氣上逆出現(xiàn)咳嗽的同時(shí)也伴有胃氣上逆所致的惡心、嘔吐，還是內(nèi)熱導(dǎo)致的腹瀉及便秘，定喘湯均可以發(fā)揮其降氣、清熱、收斂澀腸的功效得到解決。故從臨床角度可證實(shí)，定喘湯既可治療RSV感染后引起的呼吸系統(tǒng)癥狀，又可緩解其導(dǎo)致的胃腸道癥狀。

RSV感染可使機(jī)體膽汁酸代謝發(fā)生改變，同時(shí)也間接影響了腸道菌群的變化。人及動(dòng)物的腸道內(nèi)擁有復(fù)雜的微生物群落，并發(fā)揮著生物屏障、免疫調(diào)節(jié)及營(yíng)養(yǎng)支持等作用，而這其中膽汁酸與腸道細(xì)菌卻具有相互依賴(lài)、相互競(jìng)爭(zhēng)、相互抑制的復(fù)雜關(guān)系[8-9]，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RSV感染大鼠后機(jī)體膽汁酸代謝變化來(lái)間接探討了其腸道內(nèi)菌群變化。PCA散點(diǎn)圖顯示，正常組和RSV感染組的血清樣本能夠完全分離，說(shuō)明兩組的血清膽汁酸代謝物譜有明顯的差異，進(jìn)而提示RSV感染后機(jī)體膽汁酸代謝出現(xiàn)紊亂。結(jié)果顯示，RSV感染大鼠后機(jī)體檸檬酸(CA)、牛磺膽酸(TCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、7-酮基脫氧膽酸(7-ketodeoxycholic acid)及苯乙酸(Phenylacetic acid)均發(fā)生改變。脫氧膽酸屬于次級(jí)膽汁酸，是初級(jí)膽汁酸在腸道內(nèi)受到細(xì)菌作用，進(jìn)行7α脫羥作用生成的膽汁酸；而鵝脫氧膽酸則是次級(jí)膽汁酸被腸道的代謝產(chǎn)物重吸收生成的，可見(jiàn)膽汁酸代謝是受腸道菌群影響的。生理狀態(tài)下，腸道內(nèi)膽汁酸激活FXR后，可以維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)，防止細(xì)菌移位，抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)[10-11]。而本結(jié)果顯示RSV感染大鼠后機(jī)體膽汁酸代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化，這在一定程度上說(shuō)明了其腸道菌群也相應(yīng)的發(fā)生了變化，即RSV感染大鼠存在腸道菌群失調(diào)的狀態(tài)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，病毒可通過(guò)黏膜-免疫反應(yīng)損傷腸道黏膜并改變腸道菌群組成，流感病毒感染小鼠后可使其腸道內(nèi)腸桿菌和腸球菌明顯增加，乳酸桿菌和雙歧桿菌的量則顯著降低[12]，且有文獻(xiàn)報(bào)道，在RSV誘導(dǎo)的哮喘急性發(fā)作小鼠模型中，口服約氏乳酸桿菌可以明顯改善RSV誘導(dǎo)的哮喘反應(yīng)[13]。可見(jiàn)，呼吸道病毒感染不僅會(huì)導(dǎo)致局部菌群變化如上呼吸道、下呼吸道，還會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)端如腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，而腸道的菌群變化反過(guò)來(lái)通過(guò)全身反應(yīng)又可影響呼吸道的防御作用。

RSV感染大鼠經(jīng)定喘湯干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，其不僅通過(guò)膽汁酸代謝而且可直接通過(guò)腸道吸收來(lái)調(diào)節(jié)菌群紊亂。大量研究均證明中藥能夠顯著調(diào)整腸道菌群失調(diào)、促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)、抑制有害菌過(guò)度繁殖，平衡這些益生菌和致病菌的數(shù)量，從而使腸道內(nèi)環(huán)境保持健康的狀態(tài)[14]。PCA散點(diǎn)圖顯示，定喘湯和RSV感染組的血清樣本能夠完全分離，說(shuō)明兩組的血清膽汁酸代謝物譜有明顯的差異。結(jié)果顯示，定喘湯干預(yù)后膽汁酸變化趨于平緩變化，各指標(biāo)均有所回調(diào)，提示定喘湯可能影響RSV感染大鼠血清中的膽汁酸代謝物，從而對(duì)其體內(nèi)的膽汁酸代謝紊亂及腸道菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)。其中苯乙酸屬于多酚類(lèi)，由黃酮類(lèi)化合物經(jīng)腸道微生物代謝C環(huán)斷開(kāi)，生成B環(huán)酚酸類(lèi)物質(zhì)，黃酮醇經(jīng)代謝C環(huán)開(kāi)裂生成。諸多實(shí)驗(yàn)證明黃酮類(lèi)化合物對(duì)腸道細(xì)菌的數(shù)量和種類(lèi)有一定的影響[15]，某些黃酮類(lèi)化合物具有抗菌作用，會(huì)抑制腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)某些黃酮類(lèi)化合物及其代謝產(chǎn)物可以刺激降解菌生長(zhǎng)使其成為優(yōu)勢(shì)菌群。由此可見(jiàn)，腸道菌群在整個(gè)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，與黃酮類(lèi)化合物在體內(nèi)的代謝密不可分。多酚以及其被腸道菌群代謝的產(chǎn)物，能選擇性調(diào)節(jié)腸道中易感微生物的生長(zhǎng)，選擇性的促進(jìn)有益菌群(如乳酸菌)生長(zhǎng)，抑制有害菌的增殖，也即引發(fā)腸道微生態(tài)的改變[16]。

本文通過(guò)中醫(yī)“肺與大腸相表里”“肺腸同治”理論，基于在定喘湯干預(yù)RSV感染大鼠效應(yīng)驗(yàn)證基礎(chǔ)上，應(yīng)用LC-MC技術(shù)分析大鼠血清中膽汁酸代謝產(chǎn)物，結(jié)合模式識(shí)別和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)與定喘湯抗RSV感染作用相關(guān)的潛在的膽汁酸代謝標(biāo)志物，進(jìn)而驗(yàn)證了定喘湯不僅可以直接作用于RSV感染引起的肺部炎癥，調(diào)節(jié)免疫平衡，止咳平喘，而且還可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體膽汁酸代謝途徑間接調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，即“肺腸同治”，也為深入探討定喘湯的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。