野生灰樹花種質資源篩選與評價

陶祥生 黃衛華

（浙江省慶元縣食用菌科研中心，浙江慶元323800）

灰樹花（Grifola frondosa），又名栗子蘑、貝葉多孔菌、云蕈、舞茸等，隸屬擔子菌門（Basidiomycota），蘑菇綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），薄孔菌科（Meripilaceae），樹花菌屬（Grifola）。浙江慶元縣有近30年栽培灰樹花歷史，目前是浙江省唯一的灰樹花產區，年栽培量達1600余萬袋，為全國最大的灰樹花生產地之一。當前慶元縣灰樹花品種僅“慶灰151”“慶灰152”，品種單一。為此，筆者對收集野生灰樹花種質資源進行對比試驗，對其遺傳特征進行初步的分析和評價，以期為篩選馴化優良灰樹花菌株及育種材料提供理論依據和基礎材料。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試栽培菌株：3個栽培菌株為慶元縣食用菌科研中心的慶灰151、慶灰152和河北燕山科學試驗站選育的小黑汀（河北遷西灰樹花主栽品種）（表1）。

供試野生菌株：8個野生灰樹花菌株均為筆者野外收集分離而得（表1）。

1.2 培養基

PDA固體培養基：1000 mL水加馬鈴薯200 g（用浸出汁），葡萄糖20 g，瓊脂 20 g。培養基pH自然。

表1 供試野生及栽培灰樹花菌株

栽培料配方：雜木屑34%，棉籽殼34%，麩皮10%，玉米粉 10%，山表土 10%，石膏粉 1%，紅糖1%。料水比 1∶1.1～1.2，pH 自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試灰樹花菌株拮抗試驗

將各參試菌株兩兩組合，分別在每個組合平板中心線兩側接入兩個不同菌株菌絲塊，每個平板3次重復。25℃倒置培養，觀察菌絲接觸區有無對峙反應。若受檢菌株間無帶線出現，則表示2個受檢菌株的基因極相似或相同，說明種緣關系近；若受檢菌株間形成帶線，則表示2個受檢菌株種緣關系遠，是不同菌株。

1.3.2 供試灰樹花菌株特異性鑒定

檢測方法采用農業行業標準NY∕T 1730－2009《食用菌菌種真實性鑒定ISSR法》。ISSR檢測方法嚴格按照標準NY∕T 1730－2009進行操作，選用了標準附錄B中提供的28對ISSR引物中的20對進行檢測。每對引物3次重復。電泳結果拍照并統計條帶差異。另外，采用SRAP分子標記進行補充鑒定。反應體系為：總體積25 μL，包括10×PCR buffer（Promega）2.5 μL，25 mmol∕L MgCl2（Promega）1.8 μL，模板（50 ng∕μL）1.0 μL，正反向引物（20 μmol∕L）各0.38 μL，Taq 酶（5 U∕μL）（Promega）0.3 μL，10 mmol∕LdNTPs 0.5 μL。反應條件為94℃ 5 min，前5個循環，94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，后35個循環退火溫度為50℃，最后72℃ 10 min。反應結束后，取6 μL PCR產物于1.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，拍照記錄。選取特異性較好的20對引物進行擴增，每對引物3次重復。

表2 拮抗試驗結果

1.3.3 供試菌株菌絲生長比較

將分離純化后的供試灰樹花菌株轉接到培養基平板上，25℃恒溫暗培養15 d，用打孔器取直徑為5 mm菌餅接種到PDA培養基平板中央，置于25℃恒溫暗培養。培養7 d后觀察菌落生長情況，并采用“十”字交叉法測量菌落直徑，之后每天測量一次菌落直徑，連續測量8 d，每種處理設6個重復。計算菌絲平均生長速度，觀察記錄菌絲長勢。

1.3.4 供試灰樹花出菇對比試驗

栽培袋（15 cm×50 cm×0.005 cm）裝濕料1.7～1.9 kg，98～100℃滅菌14～15 h后冷卻，接種。每袋接種3穴，接種后再套外袋。

取5袋，25℃暗培養，菌絲萌發后開始測量，每2d劃線1次。記錄接種到菌絲長滿袋的時間、接種到形成子實體的時間。觀察比較菌棒發菌差異。

菌絲長滿袋（40～45d），第1次刺孔增氧，每棒均勻刺孔25～30個，進入后熟期（10～20d），后熟期結束，就選擇菌絲濃密處割口搔菌（割“V”，長1.5～2 cm，深約2～3 mm，刮去菌皮及少許培養料，每個菌棒割口1處），保持空氣相對濕度85%～90%、溫度22℃左右（恒溫），CO?控制在1000 mg∕kg以下，培養7～10d在割口處即可形成原基。形成原基后移入出菇大棚，增加光照強度（200～500 lx），保持空氣相對濕度85%～90%，并加強通風，一般15～20d后子實體發育成熟。采收記錄第一潮袋栽和第二潮覆土出菇產量，計算袋單產。每個菌株100棒，3個重復。

2 結果與分析

2.1 拮抗試驗

拮抗試驗結果供試11個菌株兩兩組合均發生拮抗反應，說明供試菌株親緣關系較遠（表2）。

2.2 特異性分析結果

將11個菌株送上海農科院食用菌研究所進行特異性鑒定。灰樹花待檢菌株與對照菌株采用20對ISSR引物及20對SRAP引物進行特異性鑒定。結果顯示：灰樹花所有待檢菌株與對照慶灰151、慶灰152和小黑汀相比均具有特異性，且待檢菌株相互之間也具有特異性。限于篇幅，ISSR擴增及SRAP擴增譜圖譜略。

2.3 平板培養菌絲生長情況

11個供試灰樹花菌株平板培養結果見表3。

表3 供試灰樹花菌株平板培養菌絲生長比較

圖1 2號灰樹花菌株子實體

圖2 8號灰樹花菌株子實體

圖3 14號灰樹花菌株子實體

從菌絲顏色、長勢以及形態來看，2號、8號、14號、15號等4個菌株菌絲表現出較好的生長勢，菌絲生長旺盛，其中14號菌株菌絲生長速度最快，但菌絲顏色不如2號、8號、15號潔白。

2.4 栽培試驗結果

灰樹花栽培從接種到采收所需時間越短意味著菌袋占場地時間越短，越有利于降低成本，這是篩選灰樹花菌株重要指標。從表4可以看出，采自于慶元百山祖高海拔地區的2號、14號形成子實體的時間較晚，具有馴化和選育低溫型品種的潛力。

表4 供試灰樹花菌株菌絲滿袋、原基所需形成時間

供試灰樹花菌株產量見表5。

從表5中可以看出8號、14號、19號、15號野生灰樹花菌株產量較高，接近主栽品種慶灰151、慶灰152。

3 小結

拮抗試驗、分子生物學鑒定表明，所有野生灰樹花菌株與對照慶灰151、慶灰152和小黑汀相均具有遺傳差異性，且供試野生灰樹花菌株之間也具有遺傳差異性。

表5 供試灰樹花菌株產量比較

2號、8號、14號、15號，4個野生灰樹花菌株菌絲表現出較好的生長勢，菌絲生長旺盛。

采自于慶元百山祖2號、14號形成子實體的時間較晚，可以作為選育低溫型灰樹花品種的種質資源。

8號、14號、19號、15號野生灰樹花菌株產量較高，接近主栽品種慶灰151、慶灰152有望成為兩品種的后備品種。