裂褶菌液體培養條件優化及其發酵液功效檢測

邴 雪 甄英鑫 史豆豆 安 全 蘇 寧 王昌濤 李 萌

（1北京工商大學理學院∕北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京100048；2云南白藥集團有限公司，云南昆明650118；3中國檢驗檢疫科學研究院化妝品技術中心，北京朝陽100176；4北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京海淀100048）

裂褶菌（Schizophyllum commun）別名樹花、雞毛菌、白花、白參等，屬于真菌門，擔子菌綱，傘菌目，裂褶菌科，裂褶菌屬（Schizophyllum）[1]。在段木栽培木耳、香菇及銀耳或者毛木耳有時產生的“雜菌”——裂褶菌，其繁殖速度快，繁殖量大，嚴重時，還可使木質部產生白色腐朽。世界各地均有裂褶菌分布，在我國主要分布于河北、黑龍江、遼寧、內蒙古、安徽、江蘇、浙江、湖南、甘肅、福建、海南、四川、貴州等省區。據云南省農科院測試中心對人工栽培的裂褶菌分析，裂褶菌中人體必需的8種氨基酸總含量達17.04%，并富含鋅、鐵、鉀、鈣、磷、硒、鍺，有較高的藥用價值。據《新華本草綱要》等籍記載，此菌“性平，味甘，氣味（根）苦、微寒、無毒”。對小兒盜汗、婦科疾病、神經衰弱、頭昏耳鳴等癥療效明顯。裂褶菌是食藥兼用的珍稀菌，有清肝明目，滋補強身的功效。國外對裂褶菌的遺傳、生理研究開展較早，我國則側重研究菌絲體的發酵條件、人工馴化栽培和藥用價值[2]。

裂褶菌素是由裂褶菌分泌的胞外多糖，是以主鏈為β-（1，3）糖苷鍵連接，支鏈β-（1，6）連接的β葡聚糖[3]，具有β-1，3-D葡聚糖的獨特結構活性和良好的水溶性，在調節免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面具有顯著的效果。裂褶菌素具有的獨特結構特性，使其生物活性高于其他真菌多糖。夏冬等發現裂褶菌多糖對延緩衰老有幫助原因是它可以促進機體細胞免疫功能和機體的體液免疫應答，并在恢復老年動物細胞免疫及體液免疫的功能方面有良好表現[4]。張雖栓等人研究表明，以酵母粉0.8%和硝酸銨0.2%為混合氮源，加入3-吲哚乙酸0.04%、磷酸二氫鉀0.3%、葡萄糖12%的培養基培養菌絲，接種量為13%的發酵條件下多糖提取率較高，其質量分數達1.768%[5]。張琪等人研究裂褶菌多糖的保濕成分，結果表明其能作為護膚保濕產品添加物，其保濕能力較常見的保濕劑成分燕麥β-葡聚糖強，可以開發作為日用化妝品中的保濕劑成分[6]。故裂褶菌素在食品生產、醫藥衛生、生物、化妝品等方面應用廣泛。試驗對裂褶菌的發酵培養基進行優化，旨在提高裂褶菌素的產量，并在優化培養基條件下得到的發酵液進行性質檢測，分析其抗氧化和美白功效，為研究開發相關化妝品提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試裂褶菌菌株

裂褶菌菌株來源于中國科學院微生物研究所，編號5.120。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖，北京拜爾迪生物技術有限公司；玉米淀粉、糊精、蔗糖、剛果紅、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏，上海麥克林生化科技有限公司；KH2PO4、MgSO4、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉，北京化學試劑公司；黃豆餅粉，市售；花生餅粉，市售；濃硫酸，北京化工廠；牛血清蛋白，天津凱茵科技有限公司；L-酪氨酸酶，上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 裂褶菌的培養條件優化

1.3.1 單因素法優化培養基

分別以碳源、氮源和pH為單因素，以裂褶菌菌體干重和裂褶菌素含量為考察指標，對裂褶菌培養基進行優化。碳源有葡萄糖、淀粉、糊精、蔗糖，氮源有黃豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、牛肉膏，pH為4、5、6。每組試驗進行三個平行。先在1000 mL錐形瓶中配好所需培養基，完全溶解后，分裝于250 mL錐形瓶中，裝液量為100 mL，在28℃培養96 h。檢測其菌體干重，發酵液14 800×g離心10 min后，棄上清液，取沉淀置于已知質量的培養皿中，在40℃的烘箱中烘干至恒重，得菌絲體干重，并對裂褶菌發酵液中的裂褶菌素進行檢測，篩選出最適宜的碳源、氮源和pH。

1.3.2 正交試驗優化培養基

采用正交試驗L9（34）分析法探究裂褶菌最優培養基，因素及水平見表1。按表1在1000 mL培養基中加入相應量的玉米淀粉和酵母浸粉，完全溶解后，分裝于250 mL錐形瓶中，裝液量為100 mL，在28℃培養96 h。

表1 正交試驗因素水平

1.4 發酵液活性成分含量測定

1.4.1 多糖含量的測定

還原糖含量的測定：利用DNS法[7]。取發酵液1.0 mL于試管中，加DNS試劑2.0 mL，沸水煮沸2 min，冷卻后用水補足到15 mL，在540 nm處測定吸光度。從標準曲線中查出葡萄糖濃度，求出樣品中糖含量。

多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法[8]。取發酵液2.0 mL放入試管中，以去離子水做空白對照，加入5%的苯酚溶液1.0 mL混勻，再加入5.0 mL濃硫酸，5 min后，封管沸水浴加熱1 h。取出后冷卻至室溫，在490 nm處測吸光度。

1.4.2 蛋白質含量的測定

采用福林酚法[9]。取1.0 mL發酵液，加入5.0 mL配好的Na2CO3、NaOH、酒石酸鉀鈉與硫酸銅溶液，迅速混合放入25℃水浴鍋，水浴保溫10 min。加入0.5 mL配好的福林酚試劑，立即混合，25℃水浴反應30 min，在700 nm處測吸光度。

1.4.3 裂褶菌素含量的測定

采用剛果紅法[10]。取2.0 mL發酵液于試管中，加入4.0 mL配好的剛果紅溶液，25℃水浴反應10 min，在550 nm處測吸光度。

1.5 發酵液功效測定

1.5.1 酪氨酸酶活性抑制率

對酪氨酸酶活性抑制試驗[11]。按照表2中的數據添加L-酪氨酸、發酵液、PBS溶液；C2管在37℃水浴鍋中水浴加熱10 min，波長475 nm下調零，C1管37℃水浴10 min后，加1 mL100 U∕mL酪氨酸酶，繼續水浴10 min，測定C1吸光度值；同樣方法，以T2調零測定T1吸光度值；計算樣品對酪氨酸酶的活性抑制率。

表2 溶液配制列表 mL

1.5.2 抗氧化試驗

對DPPH自由基清除作用試驗[12]。以制得的發酵液為待測液，取等體積的待測液與2×10-4mol∕L的DPPH溶液混勻（A1管）；取等體積的水與2×10-4mol∕L的DPPH溶液混勻（A2管）；取等體積的無水乙醇與待測液混勻（A3管）；反應30 min后，在517 nm下測A1、A2、A3管吸光度值。

2 結果與分析

2.1 裂褶菌培養條件優化結果

2.1.1 單因素試驗結果

當氮源固定為酵母浸粉，pH設定為4，碳源為葡萄糖、玉米淀粉、糊精、蔗糖，試驗結果見圖1。當碳源固定為葡萄糖，pH設定為4，氮源為酵母浸粉、牛肉膏、花生餅粉、黃豆餅粉，試驗結果見圖2。氮源固定為酵母浸粉，碳源固定為葡萄糖，pH設為4、5、6，試驗結果見圖3。

試驗結果表明，當培養基碳源為玉米淀粉，氮源為酵母浸粉，pH為4時，裂褶菌菌絲生長狀態最好，菌體干重最大，且裂褶菌的發酵液中裂褶菌素的產量最高。

2.1.2 正交試驗法優化結果

試驗以裂褶菌菌絲干重和發酵液裂褶菌素含量為考察指標，試驗結果見表3、表4。

圖1 培養基不同碳源試驗結果

圖2 培養基不同氮源試驗結果

圖3 培養基不同pH試驗結果

圖4 酪氨酸酶抑制率

由表3、表4可知，影響裂褶菌菌絲干重和裂褶菌素含量的因素主次序均為碳源＞氮源＞pH，試驗最優培養條件為玉米淀粉30 g，酵母浸粉4 g，pH 4，裂褶菌菌絲干重為0.21 g，裂褶菌素的含量為2.13 mg∕mL。

2.2 發酵液活性成分

測得還原糖含量的標準曲線方程為y=0.924x+0.0523，R2=0.9985，多糖含量的標準曲線方程為y=0.923x+0.025，R2=0.997，多糖含量為 2.14 mg∕mL。測得蛋白質含量的標準曲線為y=0.0013x+0.0031，R2=0.9986，蛋白質含量為 3315.00 μg∕mL。測得裂褶菌素含量的標準曲線為y=0.038x+0.0136，R2=0.997，裂褶菌素含量為2.13 mg∕mL。

表4 正交試驗結果

2.3 酪氨酸酶活性抑制試驗結果

選用1%熊果苷溶液作為陽性對照，試驗結果如圖4所示，1%熊果苷的酪氨酸酶抑制率為95.08%，未稀釋發酵液的酪氨酸酶抑制率為47.83%。

2.4 抗氧化試驗結果

選用濃度為1%的VC水溶液作為陽性對照，DPPH自由基清除率為90.84%。發酵液的DPPH自由基清除率如圖5所示。由圖5可知，未稀釋發酵液的DPPH自由基清除率為99.20%。

圖5 發酵液DPPH自由基清除率

3 小結

單因素試驗結果表明當選擇碳源為玉米淀粉，氮源為酵母浸粉時，裂褶菌菌絲的生長狀態最為良好，菌絲體干重最大，且裂褶菌的發酵液中裂褶菌素的產量最高。正交試驗表明1000 mL培養基中加入玉米淀粉30 g，酵母浸粉4 g，pH 4，獲得裂褶菌菌絲體干重、裂褶菌素的含量最高，分別為0.21 mg∕mL，2.13 mg∕mL。未稀釋發酵液對酪氨酸酶活性的抑制率達到47.83%，說明發酵液可以很好地抑制酪氨酸酶的活性。發酵液的DPPH自由基清除率達到99.20%，可以充當自由基清除劑。試驗結果為開發裂褶菌發酵類化妝品提供參考。