桑黃原生質(zhì)體的制備與再生研究

白靜瑩 王立山 張 媛 范桂枝

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150000）

桑黃（Phellinus yucatanenisis）屬于擔(dān)子菌亞門、多孔菌目、多層孔菌科、針層孔菌屬[1]，是一種珍貴而功效多樣的藥用真菌，有“森林黃金”之美稱。桑黃最早使用記錄是從漢朝開始的，至今已有2000多年的歷史，中醫(yī)用以治療血崩、血淋、帶下、脾虛泄瀉等[2-3]。現(xiàn)代藥理研究表明，桑黃含有多糖、黃酮、三萜酸、脂肪酸類、芳香酸等成分[4]，具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗肝纖維化和增強(qiáng)免疫等藥用價(jià)值[5-6]，是國際公認(rèn)的最佳抗癌真菌之一。因此，桑黃作為名貴的滋補(bǔ)藥材，市場對其需求驟升。

野生桑黃人工栽培難度大、子實(shí)體生長周期長，一般3～4年，這限制了對桑黃的進(jìn)一步開發(fā)和利用。為了滿足日益增長的市場需求，選育性狀穩(wěn)定、子實(shí)體生長周期短和人工栽培難度小的桑黃菌種成為一項(xiàng)重要的工作。原生質(zhì)體技術(shù)是選育優(yōu)良菌種行之有效的手段，如原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體誘變和原生質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化等。其中，原生質(zhì)體的制備和再生是原生質(zhì)體技術(shù)的前提和基礎(chǔ)。祝子坪和馬海樂[7]、許謙[8]的研究分離了桑黃菌絲原生質(zhì)體并成功再生，但是上述研究均未報(bào)道桑黃菌種的寄生樹種。研究表明，桑黃孔菌屬（Sanghuangporus）常與其所生長的樹木之間存在種類專一性關(guān)系[9]，目前知道世界上桑黃屬有12種[10-12]，主要生長于楊、松、桑、白樺、暴馬丁香、杜鵑等樹的樹干上[13]。不同寄生樹種來源的桑黃菌絲中，藥用代謝物含量可能存在差異[14]，其分離的原生質(zhì)體活力、產(chǎn)量和再生能力是否相同還未見報(bào)道。為此，筆者將比較分析來源于暴馬丁香、桑樹、松樹、樺樹、楊樹桑黃等五種桑黃菌絲的原生質(zhì)體活力和產(chǎn)量以及葡萄糖和pH對原生質(zhì)體再生的影響，為利用原生質(zhì)體技術(shù)選育優(yōu)良桑黃菌種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 供試材料

五種不同樹種的桑黃子實(shí)體分別為暴馬丁香桑黃（Sanghuangporus baumii）、桑樹桑黃（Sanghuangporus sanghuang）、松樹桑黃（Phellinus igniarius Linn）、樺樹桑黃（Phellinus igniarius）、楊樹桑黃（Sanghuangporus vaninii），均由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院森林生物工程學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供，該菌種已從形態(tài)和分子水平鑒定[15]。

1.1.2 主要試劑

崩潰酶（北京索萊寶科技有限公司），蝸牛酶（北京百泰生化技術(shù)公司），二乙酸熒光素（FDA）（上海瑞永生物科技有限公司），由本地市場購得葡萄糖、甘露醇等均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g沸水煮30 min，4層紗布過濾。取濾液，加入20 g葡萄糖，補(bǔ)水至1000 mL，pH自然。

PDA培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基再加10%瓊脂粉。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母粉4 g，溶于0.6 moL/L滲透壓穩(wěn)定劑中，體積為1000 mL，加入10%瓊脂粉，pH自然。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），超凈工作臺（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司），SHA-B水浴恒溫振蕩器（國旺儀器），TDZ5-WS臺式低速離心機(jī)，OLYMPUS熒光顯微鏡，酒精燈，移液槍，鑷子，0.22μm細(xì)胞篩，0.22μm微孔濾膜，尼龍紗布（64μm）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑黃菌絲體的培養(yǎng)

取PDA斜面上生長旺盛的菌絲，接種于PDB培養(yǎng)基中，28℃，130 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)15 d左右，直至菌絲長成約1 cm的球狀。

1.3.2 原生質(zhì)體制備

在超凈工作臺上，將五種桑黃菌絲用無菌水洗滌、去除表面水分后，每毫升酶解液加入300 mg菌絲，振蕩混勻，使酶液與菌絲體充分接觸。于35℃恒溫水浴鍋水浴，110 r/min振蕩酶解3 h。待酶解完成后，將五種桑黃菌酶解液用無菌雙層尼龍紗布（64μm）過濾，3800 r/min離心機(jī)離心10 min去上清液，將原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋成懸液備用。

1.3.3 原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力統(tǒng)計(jì)

（1）原生質(zhì)體活力測定（FDA染色法）：用丙酮將FDA配置成5 mg/mL溶液，將FDA溶液與原生質(zhì)體懸液按比例1∶1混勻，分別在自然光與熒光顯微鏡下觀察五種桑黃的原生質(zhì)體。在熒光顯微鏡下，有活力的原生質(zhì)體發(fā)出綠色熒光，無活力的不發(fā)光。隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)樣品重復(fù)3次，計(jì)算出在自然光下原生質(zhì)體數(shù)和熒光下有活力的原生質(zhì)體數(shù)，得出活力比。

原生質(zhì)體活力比（%）=熒光下原生質(zhì)體數(shù)（個(gè)）/自然光下原生質(zhì)體數(shù)（個(gè)）×100

（2）原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)）：吸取五種桑黃原生質(zhì)體懸液10μL于25×16血球計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下，分別在左上、右上、左下、右下、中間五個(gè)中方格，計(jì)數(shù)原生質(zhì)體數(shù)目。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

原生質(zhì)體產(chǎn)量的計(jì)算：

原生質(zhì)體的產(chǎn)量/mL=（a/5）×25 ×104×b

式中：a為5個(gè)中方格中原生質(zhì)體總數(shù)；b為原生質(zhì)體懸液稀釋倍數(shù)。

1.3.4 暴馬丁香桑黃的再生

1.3.4.1 不同葡萄糖濃度對暴馬丁香桑黃再生率的影響

取1000 mL馬鈴薯濾液，平均分為兩份，即對照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組加入54.65 g甘露醇使其濃度為0.6 mol/L，然后試驗(yàn)組和對照組平均分成五份，分別加入一定量葡萄糖使其葡萄糖濃度分別為0.01 g/mL、0.02 g/mL、0.03 g/mL、0.04 g/mL、0.05 g/mL，pH自然，每份加1 g瓊脂，溶解后121℃、滅菌20 min。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.4.2 不同pH對暴馬丁香桑黃再生率的影響

取1000 mL馬鈴薯濾液，加入葡萄糖20 g，平均分為兩份，即對照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組加入54.65 g甘露醇使其濃度為0.6 moL/L，然后試驗(yàn)組和對照組平均分成五份，調(diào)節(jié)pH為一定值。每份加1 g瓊脂，溶解后121℃、滅菌20 min。桑黃菌絲生長最適pH為 7.5，所以設(shè)定pH 五個(gè)梯度為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.5 釋放與再生的觀察

（1）桑黃原生質(zhì)體的釋放：在酶解過程中，每隔1 h取樣制片，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況。（2）桑黃再生：在無菌操作臺將桑黃精制后的懸液濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，吸取100μL懸液涂到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，27.5℃避光條件下培養(yǎng)，隨時(shí)取樣制片，觀察桑黃原生質(zhì)體再生過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的形態(tài)觀察

菌絲在酶解的過程中細(xì)胞壁被分解去除，形成的原生質(zhì)體沒有了堅(jiān)硬的細(xì)胞壁束縛，形態(tài)就會變?yōu)榍蛐位蛘呓蛐巍１R丁香、桑樹、松樹、樺樹、楊樹桑黃菌絲分別經(jīng)酶解液精制后得到的原生質(zhì)體形態(tài)如圖1所示。五種桑黃菌絲的原生質(zhì)體形態(tài)變?yōu)榍蛐位蚪蛐危珬顦渖｜S原生質(zhì)體形態(tài)與其他四種相比較不規(guī)則，可能是由于沒有了細(xì)胞壁的阻隔，原生質(zhì)體可能會發(fā)生自然聚集或融合。進(jìn)一步從熒光顯微鏡圖片可以看出桑樹和樺樹桑黃釋放的原生質(zhì)體相似，均為細(xì)胞膜附近熒光較強(qiáng)，而暴馬丁香、松樹和楊樹桑黃釋放的原生質(zhì)體相似，原生質(zhì)體表面均有熒光分布。

2.2 原生質(zhì)體的活力分析

暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹、楊樹桑黃的原生質(zhì)體活力比分別為81.82%、76.67%、76.47%、71.58%、71.11%（圖2）。其中，暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體的活力最高，楊樹桑黃原生質(zhì)體的活力最低，楊樹桑黃比暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體的活力降低了10%。

2.3 原生質(zhì)體的產(chǎn)量分析

暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹和楊樹桑黃原生質(zhì)體的產(chǎn)量分別為 3.85×105個(gè)/mL、3.14×105個(gè)/mL、2.85×105個(gè)/mL、3.57×105個(gè)/mL 和 2.42×105個(gè)/mL（圖3）。其中，暴馬丁香桑黃的產(chǎn)量最高，楊樹桑黃原生質(zhì)體的產(chǎn)量最低，楊樹桑黃比暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體產(chǎn)量降低了1.43×105個(gè)/mL。

圖1 不同樹種桑黃原生質(zhì)體鏡檢圖（10×60）

圖2 桑黃原生質(zhì)體活力比

圖3 桑黃原生質(zhì)體產(chǎn)量

圖4 不同pH對原生質(zhì)體再生的影響

圖5 不同葡萄糖濃度對原生質(zhì)體再生的影響

2.4 pH和葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質(zhì)體再生率的影響

由上述圖2和圖3可知，暴馬丁香桑黃菌絲原生質(zhì)體的活力比和產(chǎn)量最高，為此采用其分析pH和葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質(zhì)體再生率的影響。pH 6.5～8.5，試驗(yàn)組和對照組桑黃菌絲原生質(zhì)體的再生率呈先上升后下降趨勢，其中試驗(yàn)組在pH7時(shí)再生率達(dá)最高值23.67%，對照組在pH7.5時(shí)再生率達(dá)最高值23.34%（圖4）。

葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質(zhì)體再生率的影響如圖5所示。葡萄糖濃度在10～50 mg/mL，試驗(yàn)組呈先升高后降低趨勢，葡萄糖濃度在30 mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體再生率最高值19.33%，而對照組葡萄糖濃度在50 mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體的再生率最高為14.66%，其他葡萄糖濃度下再生率均在12%左右。

2.5 原生質(zhì)體釋放與再生過程

桑黃菌絲酶解1～3 h，隨著酶解時(shí)間的增加，桑黃菌絲的細(xì)胞壁首先被降解，原生質(zhì)體從側(cè)端釋放（圖6a），在酶解中期（圖6b、c），大部分菌絲被酶解為片段。該酶解過程與文獻(xiàn)報(bào)道一致，即大量菌絲由側(cè)端與頂端位膨脹，釋放更多原生質(zhì)體[16]，被釋放后的原生質(zhì)體在滲透壓穩(wěn)定劑作用下，呈現(xiàn)橢圓形或不規(guī)則形狀（圖6d）。

圖6 原生質(zhì)體釋放與再生過程鏡檢圖（10×60）

桑黃原生質(zhì)體再生過程中，桑黃原生質(zhì)體首先萌發(fā)變成短狀棒粗菌絲（圖6e），短狀棒菌絲聚合進(jìn)而再轉(zhuǎn)化為菌絲體（圖6f），菌絲體通過大量繁殖聚集變成桑黃菌株（圖6g、6h）。

3 小結(jié)

試驗(yàn)以暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹、楊樹桑黃等五種桑黃為原料，進(jìn)行了桑黃原生質(zhì)體活力與產(chǎn)量的測定。選用暴馬丁香桑黃為材料，研究pH 6.5～8.5和葡萄糖濃度10～50 mg/mL對原生質(zhì)體再生的影響，并對暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體釋放與再生過程進(jìn)行顯微攝影觀察。結(jié)果表明：試驗(yàn)所測定的五種桑黃中，暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體活力與產(chǎn)量最高，分別為81.82%和3.85×105個(gè)/mL。在pH 7時(shí)，暴馬丁香桑黃再生率最高為23.67%，葡萄糖濃度為30 mg/mL時(shí)，暴馬丁香桑黃的再生率最高為19.33%。初步摸索了桑黃菌株采用酶解法獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行釋放與再生歷程，為以后該菌種誘變體系的建立奠定基礎(chǔ)。