中華蜜蜂保種（資源）分子生物學(xué)評(píng)價(jià)方法

陳道印 蘇曉玲 趙東緒 華啟云

（金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）

1 蜜蜂保種重要性

蜜蜂對(duì)于自然界以及人類社會(huì)來(lái)說(shuō)，是一種具有巨大價(jià)值的社會(huì)性昆蟲。蜜蜂是自然界重要的授粉昆蟲，具有巨大的生態(tài)價(jià)值，在世界上已知的16萬(wàn)種蟲媒植物中，蜂媒植物占85%[1]。對(duì)于人類社會(huì)來(lái)說(shuō)，蜜蜂授粉已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮出顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）的調(diào)查結(jié)果表明，蜜蜂對(duì)世界各個(gè)地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都有顯著的促進(jìn)作用[2]。而蜜蜂生產(chǎn)的蜂蜜、蜂花粉等蜂產(chǎn)品，除了能夠提高人民的生活質(zhì)量外，還能為蜂農(nóng)帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

目前世界上人類飼養(yǎng)最多并且分布最廣的是東方蜜蜂（Apis cerana）和西方蜜蜂（Apis mellifera），它們是蜜蜂屬中的兩個(gè)不同的蜂種，在人為干預(yù)以及自然選擇的作用下又形成了許多不同的種質(zhì)資源。但目前在世界范圍內(nèi)，某一些品種因其優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀被盲目地引種，造成原有地方品種種群數(shù)量大大減少，這嚴(yán)重威脅了蜜蜂整體的種質(zhì)資源狀況。

分布于我國(guó)境內(nèi)的中華蜜蜂（Apis cerana cerana）是適應(yīng)于我國(guó)獨(dú)特森林生態(tài)系統(tǒng)的本土蜂種[3]。中華蜜蜂在長(zhǎng)期的自然選擇過(guò)程中形成了具有極強(qiáng)適應(yīng)性的形態(tài)特征與生物學(xué)特性，在西方蜜蜂引入之前我國(guó)中華蜜蜂基本保留著多個(gè)地方品種[4]。從1896年起，具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的西方蜜蜂陸續(xù)被引入我國(guó)[5]，與中華蜜蜂發(fā)生了種間競(jìng)爭(zhēng)并占據(jù)了種間競(jìng)爭(zhēng)的優(yōu)勢(shì)，也帶來(lái)了許多東方蜜蜂不曾有過(guò)的病害。同時(shí)由于西方蜜蜂具有更加優(yōu)異的生產(chǎn)性狀，蜂農(nóng)更加喜愛(ài)飼養(yǎng)西方蜜蜂，人為進(jìn)行飼養(yǎng)蜂種的更替，加劇了中華蜜蜂地方品種的丟失。近幾十年來(lái)我國(guó)本土中華蜜蜂分布范圍循序縮小，數(shù)量急劇下降，而西方蜜蜂以及其他授粉昆蟲對(duì)我國(guó)森林生態(tài)系統(tǒng)的彌補(bǔ)作用有限[6]，因此保護(hù)中華蜜蜂的種質(zhì)資源是當(dāng)前必不可少的工作。近年來(lái)，隨著中蜂的勞動(dòng)強(qiáng)度小、投入成本低、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)勢(shì)逐漸體現(xiàn)，部分地區(qū)出現(xiàn)了中蜂養(yǎng)殖熱情高漲的情況，一些地區(qū)的中蜂數(shù)量有所恢復(fù)。

中華蜜蜂的相關(guān)種質(zhì)資源鑒定工作也已經(jīng)開(kāi)展。經(jīng)過(guò)學(xué)者們的一系列形態(tài)調(diào)查研究，初步劃分出以下9個(gè)中華蜜蜂的類型：長(zhǎng)白山中蜂、阿壩中蜂、海南中蜂、西藏中蜂、北方中蜂、華南中蜂、華中中蜂、滇南中蜂、云貴高原中蜂。其中長(zhǎng)白山中蜂以及阿壩中蜂由于其明顯的形態(tài)特征以及對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的適應(yīng)性，引起了政府部門的關(guān)注，先后建立長(zhǎng)白山中蜂資源保護(hù)區(qū)以及阿壩州中蜂資源保護(hù)區(qū)。其他品種如西藏中蜂、海南中蜂等雖也具有明顯的形態(tài)以及生物學(xué)特征，但并未引起足夠的關(guān)注，受到環(huán)境變化、病害以及引種等影響，蜂群數(shù)量持續(xù)下降，亟需得到保護(hù)。廣泛分布于中國(guó)大陸的華南中蜂、華中中蜂、北方中蜂等，由于人為開(kāi)墾農(nóng)田以及病害的影響，分布區(qū)域一度收縮并且呈現(xiàn)碎片化趨勢(shì)，但近年來(lái)部分地區(qū)的中蜂種群數(shù)量有所提升。作為適應(yīng)我國(guó)森林生態(tài)系統(tǒng)的本土蜂種，中華蜜蜂的現(xiàn)狀必須引起人們足夠的重視，保護(hù)我國(guó)現(xiàn)有的中蜂種質(zhì)資源。

2 蜜蜂種質(zhì)資源評(píng)價(jià)方法

中華蜜蜂種質(zhì)資源是畜禽資源的重要組成部分，也是我國(guó)生物多樣性的重要組成部分。種質(zhì)資源的管理主要包括種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、品種保存和開(kāi)發(fā)利用，而針對(duì)種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)是資源管理最基本的環(huán)節(jié)[7]。

目前，對(duì)蜜蜂種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)主要是通過(guò)遺傳標(biāo)記從形態(tài)學(xué)特征以及生物學(xué)特性進(jìn)行。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子手段對(duì)蜜蜂種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)的工作也逐漸開(kāi)展。

2.1 分子遺傳標(biāo)記評(píng)價(jià)方法

分子遺傳標(biāo)記技術(shù)由于可以直接反映生物個(gè)體或種群間的特征，已得到了廣泛應(yīng)用，是一種有效的遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記是可檢測(cè)并且穩(wěn)定遺傳的生物大分子，可直接反映基因水平上的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性等差異。至今，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記和線粒體DNA片段標(biāo)記，是蜜蜂種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與鑒定中應(yīng)用最廣泛的分子遺傳標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性SNP標(biāo)記作為第三代分子標(biāo)記將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

2.1.1 微衛(wèi)星DNA

微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellite），又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）或短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs），通常由2～6個(gè)核苷酸重復(fù)構(gòu)成，均勻分布在真核生物基因組中。這種簡(jiǎn)單重復(fù)序列在寄居蟹的基因組中第一次發(fā)現(xiàn)[8]，隨后在其他動(dòng)物、酵母的基因組中都有發(fā)現(xiàn)，并且在研究人類基因組的微衛(wèi)星序列時(shí)，得到了微衛(wèi)星（microsatellite）的名字[9]。

2003年，西方研究者從西方蜜蜂的全基因組片段構(gòu)建文庫(kù)和細(xì)菌人工染色體克隆文庫(kù)中一共開(kāi)發(fā)了552個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，而其中有58%的位點(diǎn)可以在東方蜜蜂中成功擴(kuò)增并具有多態(tài)性[10]。2008年，利用西方蜜蜂全基因組開(kāi)發(fā)出了共2008個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)[11]。而東方蜜蜂微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)相對(duì)西方蜜蜂較晚，2009年日本學(xué)者成功地在東方蜜蜂中開(kāi)發(fā)出12個(gè)具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)[12]。除此之外，東方蜜蜂使用的微衛(wèi)星標(biāo)記，多是基于西方蜜蜂已有的位點(diǎn)篩選出在東方蜜蜂中具有多態(tài)性的標(biāo)記[13]。在蜜蜂領(lǐng)域內(nèi)，微衛(wèi)星被用于遺傳多樣性以及蜜蜂品種鑒定的研究[14]。

2.1.2 線粒體DNA標(biāo)記

線粒體DNA是唯一的處于細(xì)胞核外的遺傳信息載體，其遺傳特性主要體現(xiàn)在：母性遺傳、多態(tài)、同一個(gè)體內(nèi)線粒體序列一致。線粒體具有高度多態(tài)、母系遺傳、較少重組以及高拷備數(shù)等特點(diǎn)，是研究中一種常見(jiàn)的分子標(biāo)記[15,16]。在蜜蜂的研究領(lǐng)域中，一個(gè)蜂群通常有且僅有一只蜂王負(fù)責(zé)產(chǎn)卵，整個(gè)蜂群的線粒體結(jié)構(gòu)一致，因此在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一只工蜂的線粒體就足以代表整個(gè)蜂群的特征。基于線粒體DNA標(biāo)記的特點(diǎn)以及蜂群母系社會(huì)的特性，線粒體常被用于研究蜜蜂的分化鑒定等領(lǐng)域[17,18]。

隨著分子檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子實(shí)驗(yàn)的成本大大降低，對(duì)線粒體序列片段進(jìn)行直接測(cè)序以獲得豐富的遺傳信息變得可行，因此線粒體部分片段測(cè)序成為種質(zhì)資源多樣性檢測(cè)所使用的主要技術(shù)之一。在蜜蜂領(lǐng)域的研究中，tRNAleu～COII的非編碼區(qū)為主要檢測(cè)的線粒體片段，在近緣種西方蜜蜂的研究中起到了很好的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)作用[17,19]。在東方蜜蜂的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，雖然該非編碼片段的變異程度相比西方蜜蜂有所減少，但仍然具有豐富的多態(tài)性[20]，依然適用于蜜蜂種質(zhì)資源多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)。此外，COI、COII、16s RNA、Cytb等線粒體DNA片段也被應(yīng)用于東方蜜蜂的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中。

2.1.3 單核苷酸多態(tài)性SNP標(biāo)記

單核苷酸多態(tài)性簡(jiǎn)稱SNP標(biāo)記，是指基因組上某個(gè)特定位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化，且該等位基因在種群中的比例不低于1%[21]。SNP標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣和遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)，廣泛分布于基因組的編碼序列或非編碼區(qū)中。其中位于編碼區(qū)內(nèi)部的SNP位點(diǎn)（cSNP）較少，但對(duì)于研究生物的表型性狀等具有非常重要的意義，可以作為鑒定不同種質(zhì)資源的重要標(biāo)記[22]。第三代高通量測(cè)序技術(shù)的推廣也為SNP的研究提供了便利。研究表明西方蜜蜂存在約830萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)，其中分布于非洲的A支系擁有最高的基因突變頻率，存在約650萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)，位于歐洲大陸的C支系僅有約220萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)，不同支系的西方蜜蜂支間約有43%的SNP位于蛋白編碼區(qū)中[23]。在篩選西方蜜蜂抗白堊相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)SNP C2587245T位點(diǎn)與西方蜜蜂抗白堊病性狀高度相關(guān)[24]。隨著測(cè)序成本的逐漸降低，SNP標(biāo)記將會(huì)在蜜蜂領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

2.2 分子水平種質(zhì)資源評(píng)價(jià)相關(guān)指標(biāo)

對(duì)種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)，常用的指標(biāo)有核苷酸多樣度、平均核苷酸差異數(shù)、單倍型多樣度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、觀察雜合度、期望雜合度、香農(nóng)指數(shù)、基因豐富度等。

2.2.1 核苷酸多樣度（Pi）

核苷酸多樣度是指在一份樣本中，隨機(jī)挑選兩個(gè)序列比對(duì)，每一個(gè)位置可能出現(xiàn)不同的核苷酸頻率，或是指不同的核苷酸位點(diǎn)在總位點(diǎn)中所占的比率[25]。

2.2.2 平均核苷酸差異數(shù)（K）

平均核苷酸差異數(shù)是將全部個(gè)體核苷酸變異數(shù)的總和除以個(gè)體總數(shù)[25]。

2.2.3 單倍型多樣度（Hd）

單倍型多樣度是指在一份樣本中隨機(jī)抽到兩個(gè)不同單倍型的頻率，越高的單倍型多樣度意味著種質(zhì)資源的多樣性越豐富[25]。

2.2.4 雜合度

雜合度主要包括觀察雜合度和期望雜合度兩個(gè)指標(biāo)，雜合度的高低與種群的適合度相關(guān)，若雜合度指標(biāo)下降，意味著該種群滅絕的可能性增加[26]。

觀察雜合度（Ho），是指每個(gè)位點(diǎn)實(shí)際觀察到的雜合子的比例。期望雜合度（He），是指在Hardy-Weinberg平衡條件下，理論上雜合子所占的比例[27]。

2.2.5 多態(tài)信息含量（PIC）

多態(tài)信息含量，簡(jiǎn)稱PIC值，指用作連鎖分析的父本與母本的配對(duì)而產(chǎn)生的子代中遺傳標(biāo)記多態(tài)性的信息量。目前僅在關(guān)于人類的研究中認(rèn)定PIC值≥0.6為具有豐富的多態(tài)信息含量[28]，對(duì)于其他物種的判斷尚未有明確的標(biāo)準(zhǔn)。在蜜蜂種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)鑒定中，如何判斷PIC值的水平需要進(jìn)一步研究。

2.2.6 香農(nóng)指數(shù)（I）

香農(nóng)指數(shù)多應(yīng)用于物種或種下的多樣性評(píng)價(jià)。在研究種質(zhì)資源多樣性時(shí)，香農(nóng)指數(shù)不僅可以體現(xiàn)等位基因數(shù)量的多少，還體現(xiàn)了不同等位基因所占的比例[29]。

2.2.7 基因豐富度（Rs）

基因豐富度也叫平均等位基因數(shù)（Na），表示每個(gè)位點(diǎn)上所有的等位基因的數(shù)量。由于受到有效種群大小的影響，該指標(biāo)能夠反映種群數(shù)量在歷史上的波動(dòng)。

2.2.8 有效等位基因數(shù)（Ne）

有效等位基因數(shù)是指在理想狀態(tài)下，形成與實(shí)際種群中相同的純合度（或雜合度）所需要的等位基因數(shù)。研究中常用平均有效等位基因數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)種群遺傳多樣性水平。

2.2.9 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)

Hardy-Weinberg平衡認(rèn)為在理想種群中，各等位基因的基因頻率和基因型頻率將保持在一個(gè)穩(wěn)定不變的水平。Hardy-Weinberg平衡受自然選擇、人工選擇、近交等諸多因素的影響，檢驗(yàn)種群是否符合Hardy-Weinberg平衡，是評(píng)價(jià)種質(zhì)資源的基礎(chǔ)[30]。

2.2.10 F統(tǒng)計(jì)量

F統(tǒng)計(jì)量包括3個(gè)參數(shù)，分別為種群間近交系數(shù)Fit、種群內(nèi)近交系數(shù)Fis、種群間的分化程度Fst[31]。Fis、Fit分別相當(dāng)于地方種群和所有種群中任何個(gè)體攜帶的一對(duì)等位基因是同源的概率；Fst是指任意兩個(gè)種群間的變異占所有變異的比例，是衡量?jī)蓚€(gè)種群分化的一個(gè)參數(shù)。

3 結(jié)語(yǔ)

蜜蜂種質(zhì)資源保護(hù)是一項(xiàng)長(zhǎng)期的任務(wù)，除了需要人類在保護(hù)自然環(huán)境方面做出更多努力外，相關(guān)領(lǐng)域的研究人員更需要先對(duì)現(xiàn)有的蜜蜂種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)，運(yùn)用現(xiàn)有技術(shù)對(duì)中蜂進(jìn)行品種鑒定，并建立起中蜂保種場(chǎng)。針對(duì)已有的保種場(chǎng)也要積極進(jìn)行保種效果評(píng)估，為接下來(lái)的中蜂資源保護(hù)工作提供理論與實(shí)踐上的指導(dǎo)。