肝竇內皮細胞調節肝臟免疫耐受的研究進展①

趙亞楠 臧超然 張永宏

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院生物醫學信息中心，北京 100069)

肝竇內皮細胞(Liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)約占肝臟中非實質細胞的50%，約為肝臟血管內皮細胞的98%，比肝臟中常駐的巨噬細胞或淋巴細胞數量高出兩倍[1]，雖然其在病原體檢測、捕獲以及抗原提呈中均發揮重要的作用，但卻是誘導肝臟免疫耐受而非免疫活化的主要細胞。LSECs通過構成沒有基底膜的內皮細胞層將血液與肝細胞分離開，并在內皮細胞層和肝細胞之間形成腔隙-Disse腔，這種結構上的分割限制了肝實質和血竇腔內物質的直接接觸，但淋巴細胞可通過LSECs窗孔、LSECs之間的細胞旁連接或LSECs細胞進入Disse腔和肝實質，誘導T細胞對感染肝細胞的殺傷作用[2,3]，甚至還可通過LSECs之間的連接進行跨細胞游走。因此LSECs除攝入、加工、處理和遞呈外源性抗原物質外，還可能發揮細胞內病原體免疫監視的作用[4]。另外LSECs在調節其他肝臟功能中也發揮重要的作用，如血管張力、肝細胞生長、血管生成、肝血竇重塑或肝臟損傷修復等[5]。因此LSECs功能障礙可導致血管舒張功能障礙、炎癥反應、纖維化、肝再生功能障礙、病理性血管生成或血竇重塑等，進而導致肝硬化和門脈高壓[6-8]。本文主要通過LSECs對血液中抗原物質的清除作用、LSECs在肝內發揮免疫調節作用以及誘導肝內T淋巴細胞免疫耐受方面的可能機制進行闡述，以明確在機體感染狀態下LSECs誘導抗病毒或抗腫瘤免疫耐受的可能機制，進而深入思考針對肝內復雜的免疫調節機制，病毒抗原或腫瘤抗原誘導的免疫耗竭或免疫逃逸機制的實質是否與LSECs誘導CD8+T細胞的免疫耐受相關。

1 LSECs的清道夫作用

LSECs并非骨髓源性細胞，而是來源于肝常駐細胞，其可表達多種模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)如清道夫受體和甘露糖受體(CD206)，前者可使其發揮清道夫細胞的作用，清除血液中直徑大于200 nm的大分子物質，后者可維持LSECs正常的內吞作用[9]。LSECs攝取的大分子物質，一部分可通過轉胞作用轉移至肝細胞，進而被排泄入膽管或在肝細胞內被代謝，另一部分可以作為抗原物質被LSECs遞呈給血液循環中的幼稚T細胞。同時其還可表達協同刺激分子CD80、CD86和CD40，骨髓源性細胞的典型分子如CD4和CD11c，主要的組織相容性復合物(Major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ和MHCⅡ分子[10]，低密度脂蛋白受體相關蛋白1，肝/淋巴結特異性細胞間黏附分子-3結合非整合素分子(Liver/lymph node-specific ICAM-3 grabbing non-integrin，L-SIGN),肝臟、淋巴結竇內皮細胞C型凝集素，以及淋巴管內皮透明質酸酶受體等來調節肝臟的脂質代謝以及抗病毒免疫應答[9]。

血液循環中的抗原在肝內大多由LSECs攝取，與樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)不同的是，LSECs并不通過甘露糖受體攝取抗原而是依賴于L-SIGN或者其他C型凝集素等調節的內吞作用。抗原被內吞入LSECs后可被快速地轉運至內涵體中，并且LSECs將不同時間內攝取的抗原隨時間分隔，通過類似于傳送帶的方式提高自身的清除能力，同時這些被LSECs攝取的外源性抗原可在細胞內與內源性抗原肽競爭結合MHCⅠ分子。然而并不是所有的抗原被LSECs內吞后都發生類似的細胞內通路，那些活化CD4+T細胞和B細胞并誘導抗體產生的抗原并不會被LSECs遞呈，進而避免誘導CD8+T細胞的免疫耐受，從而發揮抗感染作用[11]。另外研究發現LSECs并不能有效地將內吞抗原遞呈給溶酶體，而是可以將內吞的分子通過載體從管腔側轉運至肝細胞，因此LSECs的轉胞作用在清除大分子物質和感染早期清除嗜肝病毒方面均發揮重要的作用[10]。但LSECs清除病毒的功能與病毒本身的毒性相關，例如與弱毒性的鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)相比，在強毒性MHV3感染的條件下，其可活化LSECs內TLR2信號通路，誘導LSECs促炎介質的釋放，抑制IL-10和NO的產生，并可促進血管血栓的形成[12]。而血小板與LSECs表面整合素αⅡbβ3和αⅤβ3結合后，可活化LSECs釋放化學趨化因子，如CXCL8和CCL2等，從而促進中性粒細胞和淋巴細胞在肝竇內的募集[13]。

2 LSECs的免疫調節作用

LSECs是肝臟內主要的免疫防御細胞和抗原遞呈細胞(Antigen-presenting cell，APC)，肝竇直徑約為5～7 μm，加上間斷的血流特點以及血液灌注壓力低，更促進了白細胞與肝內細胞的接觸。誘導肝臟免疫耐受的細胞主要是LSECs、庫否細胞(Kupffer cells，KCs)和肝細胞，各類細胞在免疫調節中的作用相互聯系但又有所不同，如LSECs誘導肝臟免疫耐受以及抗炎的功能明顯強于KCs[14]，但在炎癥條件下，KCs可分泌促炎細胞因子IL-6，后者與LSECs表面受體結合間接活化STAT3，反而發揮保護Fas誘導的LSECs和肝細胞的凋亡或肝臟損傷[15]。作為非專職APC，LSECs表面可表達多種免疫受體、協同受體、協同刺激分子和黏附分子等與淋巴細胞相互作用所需的分子，如各種PRRs：TLR、 NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)、MHCⅠ和MHCⅡ、協同刺激分子CD80和CD86等。LSECs誘導的免疫耐受與其表面表達限制性TLR和其分泌的抗炎細胞分子相關，而活化NLRs則可抑制LSECs誘導的免疫耐受，促進T細胞免疫應答[16]。LSEC與腫瘤細胞免疫耐受及腫瘤肝內轉移均相關，經肝內血源性播散的時候可由肝NK1.1+細胞誘導腫瘤細胞的凋亡，其凋亡的腫瘤細胞片段在局部可被LSECs攝取以清除凋亡物質，但LSECs通過交叉遞呈作用可將腫瘤相關抗原遞呈給幼稚型CD8+T細胞，反而誘導其活化增殖為免疫耐受表型，導致細胞因子表達喪失、特異性細胞毒性缺乏以及腫瘤在肝內播散[17-19]。巨噬細胞和DCs等骨髓源性APC對抗原的交叉遞呈作用需要高濃度的可溶性抗原(≥20 μmol/L)，而LSECs對低濃度的抗原(≤1 nmol/L)便發揮有效的交叉遞呈作用，并且可調節肝內免疫耐受機制的形成。DCs可以根據細胞類型、分化狀態以及微環境來確定其交叉遞呈作用是誘導免疫應答還是免疫耐受，而LSECs在誘導CD8+T細胞免疫耐受同時可提高幼稚型CD8+T細胞表面Bcl-2的表達水平進而抑制免疫耐受的T細胞發生凋亡，但是在誘導特異性T細胞無功能和凋亡之前，LSECs遞呈的抗原仍可刺激CD8+T細胞增殖[20,21]。

LSECs誘導肝臟的免疫耐受機制包括表達Fcγ受體清除血液中可溶性免疫復合物、調節Tregs的產生、抑制抗原特異性DCs對T細胞的活化作用以及通過直接接觸誘導肝內活化的T細胞凋亡等，然而在肝纖維化時，LSECs可發生表型轉換，誘導Tregs產生以及抑制DCs免疫原性的功能均降低，并可釋放促炎細胞因子、活化T細胞，誘導適應性免疫應答[22-24]。在慢性酒精性肝病中，LSECs通過活化NF-κB、低氧誘導因子-1α和轉錄因子AP-1來提高調節活化正常T細胞表達與分泌的趨化因子的表達發揮促炎作用，而在非酒精性脂肪性肝炎中，LSECs通過降低趨化因子如CCL2和CXCL16等的表達，抑制單核細胞向炎性部分的浸潤，進而發揮抗炎癥作用[25，26]。另外LSECs表面清道夫受體在炎性調節因子的作用下可募集CD4+T細胞至肝臟進而調節肝內的炎癥反應，并且在調節腫瘤免疫中發揮作用[27]。

LSECs活化幼稚型CD8+T細胞并不依賴于炎癥反應調節的協同刺激分子的上調，由此表明在病毒尚未誘導炎癥反應階段即可發生LSECs交叉活化作用。在HBV病毒感染時，血液中存在大量的HBV表面抗原(HBsAg)并由DCs發生交叉遞呈作用[28]，然而不成熟的DCs則可誘導HBsAg特異性CD8+T細胞的無功能或耗竭。而LSECs活化幼稚型病毒特異性CD8+T細胞則可以保護T細胞的清除，且LSECs交叉活化CD4+T細胞可輔助上調HBV特異性CD8+T細胞的數量，進而增強T細胞對病毒感染肝細胞的效應功能[29,30]。但LSECs交叉遞呈HBV抗原至特異性CD8+T細胞的功能障礙，與HBV逃避非典型CD8+T細胞效應功能導致持續的病毒感染有關[31]。另外，HBV感染的持續存在也是因為在急性感染期間固有免疫應答的缺陷以及在缺乏炎癥反應的條件下病毒抗原的大量釋放導致的，這兩種狀態均缺乏炎癥反應和循環中病毒抗原的大量釋放與誘導T細胞發展為耗竭表型有關[32]。除了經典的MHC-Ⅰ限制性識別病毒感染的肝細胞外，由LSECs交叉遞呈肝細胞源性病毒抗原至CD8+T細胞，并誘導其活化的過程稱為非經典CD8+T細胞效應功能，由該途徑活化的T細胞釋放的控制炎癥反應的細胞因子主要為TNF，而非干擾素(Interferon，IFN)[33]，TNF可活化病毒感染的肝細胞內TNF受體信號通路，進而活化細胞凋亡蛋白酶，誘導病毒感染的肝細胞死亡[34]。

3 LSECs誘導CD8+T細胞免疫耐受

CD8+T細胞在肝內的黏附可發生在感染區無炎癥反應的條件下，與淋巴細胞在血管后微靜脈黏附機制不同的是，肝竇中CD8+T細胞的運動速度比肝血竇內血液流速慢500～1 000倍，且其運動不依賴于肝竇內的血流方向[35]，而黏附于募集在LSECs表面的血小板上，這可能與血小板募集改變局部的血流動力學有關，但也可能存在不依賴于血小板的黏附機制[31,36]，另外肝內低灌注壓、不規則灌注以及非選擇素依賴的黏附均是抗原特異性幼稚型CD8+T細胞黏附至LSECs的原因。肝細胞、不成熟的DCs以及非實質細胞如KCs和LSECs均可誘導CD8+T細胞的免疫耐受，其中肝細胞遞呈的抗原如自身免疫性抗原或病毒抗原還可誘導抗原特異性CD8+T細胞的清除。LSECs誘導幼稚型CD8+T細胞耐受是指其可以誘導CD8+T細胞的活化和增殖，但是當T細胞受體(T cell receptor，TCR)調節的刺激再次發生時，CD8+T細胞缺乏產生IL-2/IFN-γ的能力，即這些活化的CD8+T細胞無效應功能，故而稱為耐受[37]。

LSECs在活化幼稚型CD4+和CD8+T細胞的同時，還可通過直接接觸的方式抑制肝內DCs表達協同刺激分子CD80、CD86以及IL-2，進而抑制DCs對幼稚型CD8+T細胞的活化作用，甚至在促炎信號如IFN-γ和脂多糖誘導DCs成熟的條件下，LSECs可通過這種直接接觸作用抑制DCs活化幼稚型CD8+T細胞，同時為自身提供額外的時間來進行抗原遞呈并誘導CD8+T細胞免疫耐受，但是一旦循環中活化的CD8+T細胞數量達到一定程度，LSECs則不能干擾DCs刺激已活化的CD8+T細胞，進而使DCs繼續保持免疫監視功能[38]。同時幼稚的CD8+T細胞需受到持續有效的TCR信號刺激才可活化為效應性T細胞[39]，在缺乏炎癥信號作用下，LSECs可誘導幼稚CD8+T細胞為記憶樣T細胞，而后者在TCR、CD28和IL-12受體信號通路傳導的聯合刺激作用下可重新活化[36]。雖然IL-12是誘導CD8+T細胞活化的主要因子，但IL-12受體的表達依賴于CD28分子的協同刺激作用，LSECs與抗原特異性CD8+T細胞相互作用導致CD28的表達降低，也可導致CD8+T細胞不能有效地IL-12活化[20]。

LSECs作為APC與抗原特異性CD8+T細胞相互作用可以誘導自身表面協同抑制分子B7-H1以及幼稚型CD8+T細胞表面抑制性分子PD-1的表達水平上調，CD25和CD28分子表達降低，磷脂酰肌醇3-激酶活化受抑以及IL-2的產生降低，進而抑制T細胞的活化和功能，而且這種抑制作用持續一定時間后并不能被協同刺激信號所逆轉[40]。與肝細胞和肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)表達B7-H1來誘導T細胞凋亡不同的是，LSECs通過B7-H1信號可促進免疫耐受CD8+T細胞的生存[20]。然而進一步研究發現LSECs誘導免疫耐受或免疫活化的機制與抗原濃度有關，高濃度抗原刺激下，LSECs可活化幼稚型CD8+T細胞為效應性T細胞，而當抗原濃度較低或機體缺乏炎癥反應的條件下，LSECs誘導幼稚型T細胞上調CD69、CD44和PD-1的表達，誘導T細胞免疫耐受，且PD-1的表達水平與TCR信號的強度相關，與LSECs表面B7-H1的表達水平不相關[41]。與既往認為T細胞活化需要提高協同刺激信號的作用不同的是，在早期缺乏有效的B7-H1抑制信號的作用下，TCR信號的持續活化可誘導CD8+T細胞自身分泌IL-2，而IL-2誘導CD8+T細胞活化可不依賴于T細胞表面協同刺激信號的表達，便可誘導幼稚性T細胞分化為效應性T細胞。通常LSECs表面B7-H1分子的表達水平決定T細胞是否被誘導耐受，但是在抗原的持續作用下B7-H1的表達水平并不升高，而PD-1的水平與TCR信號有很大的關聯性，因此考慮T細胞可能具有PD-1信號的反向傳遞作用，并導致其自身的免疫耐受[41]。

4 LSECs誘導CD4+T細胞免疫耐受

LSECs表達協同刺激分子、MHCⅡ分子以及其有效攝取抗原的能力均表明其可將可溶性抗原遞呈給CD4+T細胞，并促進CD4+T細胞的增殖以及IFN-γ的釋放，且LSECs對CD4+T細胞的抗原遞呈效應可被其他的肝內細胞如HSC和KCs釋放到局部微環境中的調節因子如前列腺素E2和IL-10所調節，誘導LSECs細胞表達較低水平的協同刺激分子CD80和CD86，以及較高水平的協同抑制分子PD-L1，進而誘導LSECs通過細胞間直接接觸以及PD-1/PD-L1信號通路來抑制DCs誘導的CD4+T細胞的活化，并在不抑制其增殖的條件下抑制其炎癥細胞因子的分泌[42]。另外LSECs還可通過TGF-β或Notch依賴的信號通路將幼稚型CD4+T細胞分化為Foxp3陰性的調節性CD4+T細胞[43]，并且在炎癥環境下IFN-γ或IL-10的刺激可誘導LSECs表面凝集素表達水平升高，后者可以抑制病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的抗病毒活性，進而誘導病毒的免疫逃逸[44]。同時門脈血液中也包含可以直接影響LSECs抗原遞呈效應的調節因子如內毒素，內毒素不影響其他APC對腸源性抗原的處理能力，但是可以降低LSECs處理腸源性抗原的能力，并且降低其表面MHCⅡ分子、CD80和CD86分子的表達，上調CD54的表達，進而抑制CD4+T細胞的活化[45]，而高表達的ICAM-I還可參與調節肝內活化CD8+T細胞的清除[46]。

LSECs和DCs的抗原遞呈作用均可誘導Th1細胞活化，DCs誘導CD8+T細胞的活化需要自身功能的成熟以及CD4+T細胞的輔助，而LSECs誘導的CD8+T細胞的活化不依賴其自身功能成熟，但需要CD4+T細胞的輔助。在CD8+T細胞重定位在淋巴組織之前，LSECs激活的Th1細胞可輔助LSECs誘導CD8+T細胞的活化，且這種調節方式下的活化并不導致幼稚型CD8+T細胞耐受和抗原特異性CD8+T細胞的清除，而是導致幼稚型CD8+T細胞功能重組成為具有增殖潛能的記憶性T細胞，但在CD8+T細胞分化為記憶表型之前，Th1的活化并不誘導協同刺激分子的表達而是提高MHCⅠ的表達，后者可以增加TCR的信號傳導作用。LSECs激活的Th1細胞釋放的IL-2，其與T細胞表面高親和力的IL-2受體結合，誘導由TCR信號和IL-6反式信號聯合作用的CD8+T細胞內顆粒酶B(GzmB)的快速表達，從而發揮短暫的效應功能，而GzmB陽性的CD8+T細胞可發展為記憶性CD8+T細胞并轉移至次級淋巴組織，在TCR和協同刺激分子的共同作用下可再次活化為效應性T細胞[29,37,47]。

綜上所述，LSECs是肝臟內重要的非專職APC，其在清除病原體、代謝產物以及維持肝臟正常的生理功能和免疫調節方面發揮重要的作用，其可協同其他APC如KCs和DCs共同調節T淋巴細胞在肝臟微環境中的免疫應答以及免疫耐受作用。但肝臟病理性的改變如肝血竇結構紊亂可導致窗孔丟失，失窗孔的LSECs可活化HSC，而后者的活化反之又可調節LSECs的基因表達，兩者相互調節、相互作用可促進纖維基質的形成，誘導肝臟結構紊亂，LSECs功能改變[48,49]。例如在自身免疫性肝病中，抗LSECs自身抗體可誘導LSECs產生化學因子IL-8和單核細胞趨化蛋白-1，進而募集單核細胞和淋巴細胞至肝臟內的炎癥部位，并通過釋放多種細胞因子和化學因子導致慢性炎癥反應[50]。而在炎癥狀態下LSECs分泌膠原蛋白Ⅳ和層黏連蛋白，促進細胞外基質的形成以及LSECs的毛細血管化[51]，促進肝纖維化和肝硬化的發生和發展。而在肝纖維化或肝硬化條件下，LSECs可能失去調節T細胞的能力，進而改變肝臟的免疫狀態，導致病毒的持續存在或者抗腫瘤功能障礙。盡管在多種情況下LSECs和其他APC如DCs具有共同的表型以及遞呈外源性抗原的能力，但兩者在肝臟免疫調節方面具有不同的功能特征。通過深入了解LSECs誘導肝臟免疫耐受機制，以及感染狀態下其調節免疫應答的機制，可以為肝臟疾病的診斷、治療以及明確持續病毒感染或抗腫瘤功能障礙的可能機制提供新的有效研究思路。