腫瘤突變負荷作為非小細胞肺癌免疫療效預測標志物的研究進展①

吳 鵬 趙玉梅 楊玲麟

(西南醫科大學附屬醫院腫瘤科，瀘州 646000)

根據國際癌癥研究機構(International agency for research on cancer，IARC)最新制定的GLOBOCAN 2018標準，肺癌仍然是全球發病率和死亡率最高的癌癥(分別占11.6%、18.4%)[1]。其中，非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占85%[2]，且絕大多數患者就診時已發展為晚期,既往晚期NSCLC的治療手段主要為含鉑雙藥化療和分子靶向治療，但二者目前均進入了瓶頸期[3]。隨著免疫治療的異軍突起，特別是以程序性死亡受體-1(Programmed death-1，PD-1)/程序性死亡配體-1(Programmed death-ligand 1，PD-L1)為代表的免疫檢查點抑制劑(Immune checkpoint blockers,ICB)給部分NSCLC患者帶來了明顯的臨床獲益[4]，免疫治療逐漸成為了晚期NSCLC的研究熱點。但是，大約只有不超過30%的患者對ICB產生應答[5]，甚至部分患者出現免疫超進展[6]，因此，探索理想的療效預測標志物，從而篩選出優勢人群是當前亟需解決的問題。

PD-L1是近些年研究和運用最多的療效預測標志物，美國藥品及食品管理局(Food and drug administration，FDA)已批準腫瘤細胞PD-L1的檢測作為NSCLC接受PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑使用的伴隨診斷或補充診斷，然而，因腫瘤異質性、檢測手段未統一、PD-L1的動態變化等諸多因素導致PD-L1仍然不能成為理想的預測標志物[7]。 腫瘤突變負荷(Tumor mutational burden,TMB)是近幾年新出現的免疫療效預測標志物，研究表明，多種實體瘤接受PD-1抑制劑的有效率與TMB的表達呈線性關系[8]，而關于TMB與NSCLC接受ICB療效的研究則是當前研究最受關注的一個方面，多個報道在近兩年的AACR、ASCO及其WCLC大會上進行了交流。本文就TMB作為NSCLC免疫療效預測標志物的研究進展作一綜述。

1 TMB的定義及其作為ICB療效預測標志物的理論依據

TMB通常指每百萬堿基中被檢測出的體細胞突變的基因數目，突變包括基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤[9]。目前，TMB預測腫瘤免疫療效的機制尚不完全清楚。一般認為，TMB越高，產生新抗原的數量和頻率會增加，即機體的免疫原性增強，使得腫瘤特異性T細胞能夠對新抗原進行識別并最終產生免疫應答[10]。CTLA-4和PD-1是至今為止研究最成熟的兩個檢查點，CTLA-4通過與B7分子競爭性結合共刺激信號分子CD28從而抑制T細胞的活化，PD-1則主要通過與PD-L1結合導致T細胞耗竭，從而抑制效應T細胞的功能，導致腫瘤免疫逃逸。而ICB的作用機制則是阻斷免疫抑制信號，恢復T細胞功能，增強其抗腫瘤效應[11]。根據Chen等[12]提出的腫瘤-免疫循環概念，腫瘤免疫反應是一個多環節過程，主要包括7個步驟。因此，TMB的高表達聯合ICB在理論上可以促進腫瘤-免疫循環多步反應，最終增強抗腫瘤免疫效應。多項臨床研究已證明TMB能夠預測實體瘤接受免疫治療的療效，如黑色素瘤[13]、膀胱癌[14]、小細胞肺癌[15](Small cell lung cancer,SCLC)，關于TMB與NSCLC的研究更是層出不窮。

2 TMB對NSCLC免疫治療的療效預測作用

2.1肺癌突變譜與免疫療效：非同義突變負荷 Rizvi等[16]用全外顯子測序(Whole exsome sequenc-ing，WES)技術測定了34例接受Pembrolizumab 治療的晚期NSCLC患者的基因組，以探索NSCLC患者突變譜對免疫療效的影響。結果發現，在探索隊列中(n=16)，獲得持續臨床獲益(Durable clinical benefit，DCB)的患者中位非同義突變數明顯高于無持續獲益(No durable benefit，NDB)的患者(302 vs 148,P=0.02)；并且73%的高非同義突變負荷患者達到了DCB，而低非同義突變負荷的患者中僅13%的患者達到 DCB(P=0.04)。不僅如此，高非同義突變負荷患者的客觀反應率(Objective response rate，ORR)和中位無進展生存期(Progression-free survival，PFS)均明顯優于低非同義突變負荷患者(ORR：63% vs 0%，P=0.03；中位 PFS：14.5月 vs 3.7 月，P=0.01；HR：0.19，95%CI：0.05～0.70)，而在驗證隊列(n=18)也得到了同樣的結果。

2.2初露頭角：PD-L1預測失敗到TMB登上舞臺 CheckMate-026是一項旨在比較 Nivolumab與含鉑雙藥化療作為晚期NSCLC一線治療療效的臨床試驗[17]，該研究將PD-L1表達高于5%預設為標志物，結果卻發現該亞組患者并未從免疫治療中獲益，事后的探索性分析新增加了PD-L1≥ 50%以及TMB兩個指標，雖然PD-L1≥ 50%的肺癌患者仍未從免疫治療中獲益，但TMB卻帶來了不小的驚喜。研究者采用WES技術，將TMB≥ 243定義為高TMB，結果發現，在高TMB的患者中，Nivolumab組與化療組的ORR為47% vs 28%,且Nivolumab組的PFS也優于化療組(中位PFS：9.7月vs 5.8 月;HR：0.62;95%CI：0.38 ～1.00)。同時，TMB與PD-L1的表達無相關性(P=0.059)，但值得注意的是，在Nivolumab組中，高TMB且PD-L1≥ 50%的患者的ORR達到了75%，明顯優于其他亞組。CheckMate-026研究第一次讓腫瘤學者認為TMB可能是肺癌免疫治療更具潛力的療效標志物，并從此開啟了TMB作為肺癌免疫療效預測標志物的新篇章。

2.3再接再厲：納入前瞻性研究預設因素與預測雙ICB療效 CheckMate-026研究結束后，另外兩項前瞻性研究則讓TMB的地位進一步提高。CheckMate-568是一項評價雙ICB(Nivolumab 聯合Ipilimumab)作為晚期NSCLC一線治療的單臂Ⅱ期臨床試驗[18]，通過FoundationOne CDx平臺檢測患者腫瘤組織TMB的表達，經受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic curve,ROC)分析后發現，TMB≥ 10是篩選免疫治療優勢人群最合適的截取值，該部分患者的ORR為44%，明顯高于其他亞組及所有納入者的ORR。另一項探索雙ICB治療晚期NSCLC療效的Ⅲ期臨床試驗(CheckMate-227)則將CheckMate-568的研究成果(TMB≥ 10)作為預設因素[19]。該研究分為三部分，第一部分將對比雙免疫治療與化療組的PFS作為共同主要終點，結果首先于2018年美國癌癥研究協會年會上公布,隨后同步發表在《新英格蘭雜志》上。結果顯示，在高TMB(TMB≥ 10)患者中，雙免疫治療組的一年PFS率為42.6%，而化療組的為13.2%，兩組的中位PFS為7.2月vs 5.5月(HR：0.58，95%CI：0.41～0.81，P<0.001)，且雙免疫治療組的ORR也高于化療組(45.3% vs 26.9%)。亞組分析結果顯示，在高TMB患者中，無論其PD-L1的表達是否高于1%以及組織類型是鱗癌或非鱗癌，雙免疫治療組的臨床獲益均優于化療組。CheckMate-227是迄今為止第一篇報道雙免疫聯合治療用于晚期NSCLC的Ⅲ期臨床研究，不僅再次證明了CheckMate-012 研究中雙ICB對晚期NSCLC的有效性，同時也驗證了CheckMate-568研究中TMB截取值(TMB≥ 10)的可靠性[20]。

幾乎與此同時，同樣由Hellmann等[10]完成的一項回顧性研究也得出了類似的結果。研究團隊分析了CheckMate-012中的75例晚期NSCLC患者，采用WES檢測其腫瘤組織TMB的表達情況，結果發現，在獲得ORR和DCB中的患者TMB分別高于未獲得緩解和NDB患者(273 vs 114,P=0.000 4;210 vs 113,P=0.007 1)。高TMB(TMB≥ 158)的患者中，ORR、DCB率、PFS均優于低TMB的患者(ORR:51% vs 13%,P=0.000 5;DCB:65%vs 34%,P=0.011;PFS:HR=0.41,P=0.0024)。此外，通過描繪ROC曲線發現TMB的表達與ORR及NDB具有明顯的相關性。

3 TMB檢測技術及樣本來源

3.1腫瘤組織：WES vs NGS 上述研究中的TMB檢測樣本全部來自腫瘤組織，對于腫瘤組織樣本，目前主要有兩種檢測技術，即WES和針對不同基因Panel的靶向第二代測序技術(Next generation sequencing，NGS)，較早的研究多采用WES技術[13,16]，但是WES技術昂貴且耗時[21]，導致其不能成為常規檢測手段。相比WES，NGS檢測技術更容易在臨床上開展，CheckMate-227及CheckMate-568均采用了 FoundationOne CDx 平臺下的NGS技術檢測TMB。研究人員通過紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心的MSK-IMPACT NGS技術平臺對10 000多例遠處轉移的癌癥患者進行了基因測序，他們發現至少有9%的癌癥相關突變是WES不能檢測到的。不僅如此，MSK-IMPACT在1 597名患者(15%)中都檢測到了融合基因，其中最常見的分別是TMPRSS2-ERG、EGFRvⅢ、EML4-ALK和EWSR1-FLI1，而這些也是WES不能檢測到的[22]。

那么，WES及NGS檢測出的TMB是否具有相關性呢？NGS檢測出的TMB能夠精確地預測免疫療效嗎？Rizvi等[23]回顧性地分析了240例經ICB治療的晚期NSCLC患者，采用MSK-IMPACT NGS技術平臺檢測其TMB的表達，并對其中49例患者分別采用WES及NGS檢測TMB，結果發現，兩種檢測技術測得的TMB具有高度相關性(P<0.001)，經NGS檢測出的TMB在獲得DCB及其ORR的患者中明顯高于NDB及未獲得臨床緩解的患者(P=0.006 2、0.015 1)。進一步分析發現，對TMB進行四分位分層時，DCB比例及PFS也會隨著TMB分層的增加而增加，TMB高于第50百分位數的患者DCB率及PFS均優于TMB低于第50百分位數的患者(DCB率,38.6% vs 25.1%;P= 0.009;PFS:HR=1.38，P=0.024)。該研究不僅證實了NGS可準確估算TMB，從而預測免疫治療的優勢人群，也證明了WES和NGS檢測出的TMB呈高度相關性。2017年，美國FDA先后批準了Foundation Medicine公司的FoundationOne CDx以及MSK-IMPACT技術平臺用于癌癥基因檢測(包括TMB)，因此NGS技術將會是今后檢測腫瘤基因的主流技術。

3.2液體組織活檢技術：基于血漿的TMB(bTMB)檢測 NSCLC的治療最能體現出精準醫學的理念[24]，因此，患者在治療前要檢測多個分子標志物，如PD-L1、EGFR突變、ALK突變等。然而，約30%的NSCLC患者往往沒有足夠的組織標本用來檢測所需要的分子標志物[25]，此外，腫瘤具有異質性，某一部位的腫瘤不能代表患者的整體情況[7]，再加上組織活檢可能增加轉移風險，所以，發展無創性的檢測手段顯得十分必要。液體活檢技術是近年來發展頗為迅速的一種以循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)、循環腫瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)、循環腫瘤微RNA(microRNA，miRNA) 及腫瘤細胞來源的外泌體為檢測物質的新技術，它主要的優點是操作簡便、非侵入性、可重復性強[26]。

來自加州大學的Gandara等[25]首次證實了血漿中的TMB(bTMB)可重復測定，并且bTMB的表達與NSCLC患者接受ICB療效相關。該研究收集了來自POPLAR[27]及OAK[28]兩項研究的患者血液樣本(POPLAR及OAK均是評價PD-L1抑制劑Atezolizumab治療晚期NSCLC的臨床試驗)，采用FoundationOne CDx NGS平臺檢測其ctDNA中TMB的表達，研究團隊首先將bTMB和組織TMB(tTMB)作了比較，結果發現二者呈正相關(Spearman相關系數=0.64，95%CI：0.56～0.71)。然后經過一系列的運算，將bTMB≥16作為POPLAR研究隊列中的閾值，并通過OAK研究隊列進行驗證，分析后發現，bTMB≥ 16 的患者能從免疫治療中獲得更好的預后，Atezolizumab組的PFS和OS均優于多西他賽化療組(PFS：HR= 0.65，95%CI:0.47-0.92，P=0.013；中位OS：13.5月 vs 6.8月)。與CheckMate 568及CheckMate 227類似，bTMB預測作用與PD-L1的表達無關。

對于腫瘤組織不可用的NSCLC患者，bTMB的檢測是一種非常好的替代手段。關于bTMB的第一個前瞻性研究BFAST(NCT03178552)也正在開展，最終結果值得期待。

4 TMB與其他分子之間的聯系

PD-L1是當前研究比較成熟的分子，關于TMB與PD-L1的關系也是研究者們比較感興趣的一個部分，然而，多個研究表明兩者的表達無相關性[17,19,25]，但對PD-L1及TMB一起分析時，高TMB且PD-L1陽性的患者免疫應答率明顯高于其他組合[23,25]。Rizvi等[16]發現在獲得DCB的高TMB患者中產生了POLD1、POLE、MSH2基因缺失突變，另外，他們還發現TMB與新抗原負荷具有相關性(P<0.000 1)，而新抗原負荷的表達也能預測免疫療效。在Hellmann等[10]的研究中，TP53基因突變富集在免疫治療應答者中(P=0.048)，且TP53突變與TMB的增加高度相關，而在無應答的患者中發現了STK11及PTEN基因突變。針對EGFR基因突變的靶向治療是NSCLC治療中非常重要的部分，一項Meta分析發現，EGFR驅動基因陽性的NSCLC患者不能從免疫治療中獲益，其中的機制之一就是EGFR陽性患者整體低表達TMB[29，30]。從上述研究可以看出，TMB的表達與其他分子之間存在一定的關聯，但其中的機制和可能蘊藏的信號通路尚未闡明，今后需要大樣本量的基因分析進一步研究。

5 小結與展望

TMB作為近年來NSCLC免疫療效預測標志物的“新秀”，多個研究表明其能夠較準確地預測免疫療效，檢測技術從WES到靶向NGS的出現，檢測樣本由腫瘤組織到血液的過渡，TMB的測定逐漸變得可行和方便，有希望成為今后NSCLC免疫治療的常規檢測分子。但它仍然是不完美的，首先，TMB的檢測手段目前尚未統一，其截取值也沒有一個較精確的范圍。其次，對于腫瘤組織來源的TMB，由于腫瘤存在異質性，某個病灶的TMB不能反映整體的情況；再者，某些治療如化療和放療會對腫瘤微環境產生變化，導致患者治療前后的TMB表達情況也不一致。另外，對于bTMB的檢測，其計算方法也有值得商榷和繼續探討的地方[25]。最后，由于機體的免疫系統是一個非常復雜的體系，僅僅靠某一個分子標志物進行精確地預測療效是不大可能的，今后可以結合其他分子標志物(如免疫微環境中的CD8+T細胞等)甚至臨床預后因素，建立一個綜合預測模型，為晚期NSCLC患者帶來更有效和個體化的免疫治療。