MicroRNAs對肺癌靶向治療耐藥性的研究進展*

張潘紅，邱志宏，崔家駿

（宜春學院 1.化學與生物工程學院，2.醫學院，江西 宜春 336000）

肺癌是全球范圍內癌癥相關死亡的主要原因，大多數肺癌患者就診時已處于晚期[1]。具有生物導彈之稱的靶向治療使肺癌的治療獲得很大的進步，但隨著治療時間延長，肺癌細胞對靶向藥物產生耐藥性，嚴重影響肺癌的治療效果[2]。研究發現，異常表達的MicroRNAs（miRNAs）在肺癌細胞對分子靶向藥物產生的耐藥性中發揮重要作用，是形成耐藥性的潛在靶點[1，3]。因此，迫切需要揭秘miRNAs 在分子靶向藥物產生耐藥性中的作用。

1 miRNAs 生物學功能

1993年人類首次在秀麗隱桿線蟲中發現miRNAs，其是一個長約20 ～22 個核苷酸的小分子非編碼片段RNA，幾乎參與每個細胞生物過程，比如細胞的增殖、分化、遷移、轉移、新陳代謝及死亡等，對動物發育和體內穩態維持也起到至關重要的作用。miRNAs 生物發生因子Dicer 9 和Drosha 10 的缺失，是小鼠胚胎致死的重要危險因素[2，4]。AGO 是一個龐大的蛋白質家族，主要以單鏈小核酸為作用靶點，誘導RNA或DNA 中的互補序列發生沉默[5]。miRNAs 主要通過誘導AGO 蛋白與mRNA 的3'非翻譯區結合，形成miRNAs 誘導沉默復合物，促進mRNA 的降解和翻譯抑制[6-7]。越來越多的研究發現，miRNAs 的功能失調與人類許多疾病發生和腫瘤細胞耐藥性形成密切相 關[8]，例如根據不同作用靶點，miRNAs 可作為癌基因或腫瘤抑癌基因在癌癥的發生和進展惡化中發揮作用[9]。目前，一些miRNAs 已成為診斷癌癥、判斷癌癥患者預后及新型癌癥治療的靶標[10]。

2 miRNAs 與肺癌靶向藥物耐藥性的關系

2.1 miRNAs 與EGFR 酪氨酸激酶抑制劑的關系

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是ErB/HER 酪氨酸激酶受體家族成員之一，其與配體結合后，導致重要的構象變化，引起細胞內酪氨酸殘基磷酸化，活化下游信號轉導蛋白，調節細胞生長、侵襲、凋亡及轉移。EGFR 突變存在于許多惡性腫瘤中，是預測非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者治療反應的突出指標[11]。吉非替尼和厄洛替尼是第一代EGFR-酪氨酸激酶抑制 劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）最具代表性的藥物，主要針對具有EGFR 突變的肺腺癌患者，通過阻斷三磷酸腺苷與胞內酪氨酸激酶的結合，抑制酪氨酸殘基磷酸化，阻止下游信號轉導，從而有效抑制腫瘤細胞增殖。常與西妥昔單抗聯合治療EGFR 功能突變的肺腺癌，效果顯著，但最終會因耐藥性的產生，削弱這類藥物的細胞殺傷作用，導致靶向治療失敗[12]。

異常表達的miRNAs 與肺腺癌細胞EGFR 突變有關，嚴重影響肺腺癌細胞對吉非替尼的敏感性，參與肺腺癌細胞對EGFR-TKIs 耐藥性的調節。2009年CHOW 等[13]對10例非吸煙患者肺腺癌組織和癌旁正常肺組織進行miRNAs 基因芯片和qRT-PCR 分析，發現miR-145、Let-7 及miR-126 在肺腺癌中低表達。EGFR基因序列分析實驗結果顯示，10例肺腺癌中有7例存在EGFR突變。轉染細胞活力檢測實驗發現，在正常細胞、無EGFR突變細胞及EGFR突變細胞中，分別轉染3 種miRNAs 前體，結果EGFR突變細胞的存活率降低40%，而其他兩組細胞存活率無變化。這些結果證實miR-145、Let-7 及miR-126 對肺癌細胞生長具有抑制作用。2011年CHOW 等[14]又通過實驗證實，miR-145 表達下調與肺腺癌細胞EGFR突變有關，且異常表達的miR-145 可通過抑制靶基因EGFR的表達，提高吉非替尼的細胞毒性作用，抑制肺腺癌細胞生長。同樣以EGFR為靶基因，調節細胞生長的還有miR-146a，其可通過靶向EGFR，抑制下游信號傳導，調節細胞生長，還可增強NSCLC 中EGFR 酪氨酸激酶抑制劑和單克隆抗體的細胞毒性[15]。

2.2 miRNAs 與抗血管生成劑的關系

血管生成在腫瘤生長、侵襲及轉移中起重要作用[16]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是刺激腫瘤血管生成的重要因素，與血管內皮細胞特異性結合，促進腫瘤新生血管形成，增加血管通透性，促進腫瘤細胞轉移，是最重要的刺激新生血管形成的因子，在惡性腫瘤中高表達[17]。因此，如何利用VEGF 阻斷血管形成，抑制腫瘤生長成為近十年來分子靶向藥物研究的熱點之一[18]。目前，臨床常將抗血管生成素與化療藥物聯合使用，以提高惡性腫瘤的化療效果，例如貝伐單抗與紫杉醇-卡鉑聯合治療方案，提高NSCLC 的整體存活率[19]。目前，筆者對抗血管生成素的研究取得可喜的成績，但對VEGF如何阻斷血管形成的具體分子機制研究，仍然存在很多問題，其中包括miRNAs 對VEGF 信號通路的具體作用研究。

VEGF 及其受體FIT-1 和KDR 是形成VEGF 信號通路的主要成分[20]。CHAN 等[21]于2011年發現，異常表達的miR-200b 具有抑制內皮細胞遷移和新生血管形成的功能。同年CHOI 等[20]發現，miR-200b在順鉑耐藥的肺癌A549 細胞中表達下調，使用脂質體RNAi MAX 將人工合成的miR-200b 轉染細胞后，VEGF、FIT-1 及KDR 蛋白表達降低。血管生成實驗發現，血管內皮細胞在基底膜形成毛細血管的能力也降低。雙熒素酶分析實驗結果顯示，VEGF、FIT-1 及KDR 是miR-200b 的作用靶點，進一步驗證miR-200b是通過VEGF 信號通路發揮抑制作用。這一系列的實驗結果最終證實，miR-200b 是通過負調控VEGF、FIT-1 及KDR 在腫瘤血管形成中發揮作用。近年來研究發現，miR-126 也具有抑制腫瘤生長、侵襲及轉移的能力，并通過靶向VEGF-A 提高NSCLC 對抗腫瘤藥物的敏感性[22]。因此，深入了解miRNAs 與VEGF 信號通路的關系不僅有助于抗血管生成劑的研究，而且對提高腫瘤細胞藥物敏感性也至關重要。

2.3 miRNAs 與TRAIL 誘導細胞凋亡抗性的關系

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumour necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）超家族成員之一，也是TNF 家族中抗腫瘤活性最強的因子之一，能選擇性誘導腫瘤細胞凋亡，但對正常細胞無細胞毒性，受到國內外學者的廣泛關注[23]。TRAIL 與細胞膜表面的死亡受體TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）相互作用，誘導死亡受體與Fas 蛋白的相關死亡結構域（fas-associated death domain,FADD）結合，促進FADD 與Procaspase-8 結合，活化凋亡通路關鍵蛋白Caspase-8，誘導細胞凋亡[24]。或者TRAIL與受體結合后，經TNF 相關受體-1（tumor necrosis factor receptor-1,TNFR1）、TNFR1 相關死亡結構域（TNFR1-associated death domains,TRADD）及TNF 受體相關因子2（TNFR-associated factor 2,TRAF2）激活核因子kB（nuclear factor-kappa B,NF-kB），發揮促凋亡作用。但越來越多的研究發現，多種腫瘤細胞對TRAIL 誘導的細胞凋亡作用耐藥，且TRAIL 重復作用導致一些敏感細胞對TRAIL 產生獲得性耐藥，成為影響TRAIL 治療效果的主要障礙。

miRNAs 在TRAIL 誘導的細胞凋亡抗性中發揮重要作用。GAROFALO 等[25]于2008年在TRAIL 耐藥性NSCLC 研究中發現一種位于X 染色體短臂且具有共同調控機制的新型miRNAs：miR-221 和miR-222，并以其作為研究對象，探索TRAIL 耐藥性機制。研究發現，與TRAIL 敏感的H460 細胞系相比，miR-221 和miR-222 在TRAIL 耐藥細胞、中度耐藥的A459 細胞和A549 細胞中表達升高。轉染miR-221和miR-222 抑制劑后，TRAIL 耐藥細胞對TRAIL 誘導的細胞凋亡敏感，而轉染miR-221 和miR-222 前體的TRAIL 敏感細胞，則對TRAIL 誘導的細胞凋亡失敏，出現耐藥表型。同時使用寡核苷酸芯片技術對TRAIL 耐藥細胞進行基因表達譜分析，發現關鍵蛋白Kit 和P27kip 表達下調，進一步的深入研究最終證實，miR-221 和miR-222 是通過抑制關鍵蛋白Kit和P27kip 的表達，破壞腫瘤細胞中TRAIL 的功能，抑制細胞凋亡。細胞外信號調節激酶（extracellular regulated signal kinases,ERK1/2）的激活在細胞信號傳導和癌癥的發生、發展中發揮重要作用。GIULIA 等[26]于2012年在NSCLC 中發現miR-494 受ERK1/2 調節，抑制ERK1/2，miR-494 表達降低，BIM 表達增加。并證實異常表達的miR-494 通過下調BIM 的表達，抑制TRAIL 誘導的細胞凋亡。

2.4 miRNAs 與ALK-TKIs 抑制劑的關系

2.4.1 間變淋巴瘤激酶基因突變 在NSCLC 中，4% ～7% 患者存在間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因重排現象，也稱ALK突變[27]。該突變發生在2 號染色體短臂，常與棘皮類微管相關樣蛋白4（echinoderm microtubule-associated protein-like4,EML4）基因結合，形成具有癌基因特性的EML4-ALK[28]。克唑替尼是第一代口服的小分子間變淋巴瘤激酶-酪氨酸激酶抑制（anaplastic lymphoma kinase-tyrosine kinase inhibitors,ALK-TKIs），廣泛應用于ALK 突變的局部晚期或轉移性NSCLC 患者，效果比傳統的化療藥物好，且對ROS1基因重排的NSCLC 患者也有很好的效果[29]。但在長期的治療過程中，肺癌細胞對克唑替尼產生的獲得性耐藥，大大降低克唑替尼的抗腫瘤作用。

研究發現，miR-200 家族與許多類型腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及耐藥性的產生密切相關，miR-200c 是miR-200 家族的重要成員，在許多惡性腫瘤組織中低表達[30]。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）具有促進腫瘤免疫抑制和胚胎發育期組織重塑的作用，還參與組織愈合和器官纖維化，是腫瘤轉移、侵襲中必不可少的早期步驟[31]。2008年GREGORY 等[32]的研究發現，在乳腺癌細胞中，miR-200c 可通過介導靶基因ZEB1和SIP1的表達抑制EMT。同年PARK 等[33]也發現，miR-200 家族通過介導靶向E-鈣黏蛋白抑制因子ZEB1和ZEB2調節EMT，抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移。2016年GAO 等[34]再次證實，ZEB1是miR-200c 調節EMT 的直接靶基因，并且發現miR-200c 在克唑替尼耐藥細胞（NCI-2228/CRI）中表達降低。為揭秘miR-200c 和EMT對ALK突變的肺癌細胞產生克唑替尼耐藥性的影響， GAO 等[34]將miR-200c 模擬物轉染入NCI-2228/CRI中，通過qRT-PCR 和Western blotting 實驗結果發現，miR-200c 表達增加，間充質標志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白及CD24 的表達降低，表明高表達的miR-200c逆轉EMT；同時MTT 實驗結果顯示，NCI-2228/CRI對克唑替尼重新致敏。這些結果最終證實，miR-200c通過抑制靶基因ZEB1的表達逆轉EMT，提高克唑替尼耐藥的ALK 突變肺癌細胞對克唑替尼的敏感性[32-34]。此外，miR-150 增強克唑替尼耐藥性骨肉瘤細胞對克唑替尼的敏感性，提高克唑替尼的抗腫瘤作用[35]。

2.4.2 ROS原癌基因1重排ROS原癌基因1（ROS proto-oncogene 1,ROS1）重排非常罕見，約占0.6% ～1.8% NSCLC 患者[36]。1987年BIRCHMEIER等[37]在45 種不同人類細胞系的調查研究中，首次在神經膠質母細胞瘤中發現ROS1基因重排。2007年RIKOVA 等[38]在肺腺癌中同樣發現位于染色體6q22位點的ROS1基因重排，該基因能編碼一種屬于胰島素受體家族的受體酪氨酸激酶。研究發現，ROS1與ALK具有部分同源性，重排的ROS1基因以與ALK 異常激酶活性相似的方式，激活致癌途徑下游的信號轉導，促進肺癌細胞的增殖、遷移及凋亡[39-40]。SHAW等[41]在對50例晚期NSCLC 患者使用克唑替尼治療效果的評估中發現，克唑替尼對ROS1基因重排陽性的NSCLC 患者顯示出很好的治療效果，證實克唑替尼可通過瞄定ROS1基因重排，實現對ROS1基因重排陽性NSCLC 患者的靶向治療。

YAN 等[42]研究發現，在NSCLC 中，與鄰近正常的肺組織相比，miR-760 表達降低，ROS1 介導的蛋白表達升高，且兩者呈負相關。隨后將miR-760 模擬物轉染入A459 細胞中，發現高表達的miR-760 抑制肺癌細胞的增殖和遷移。通過TargetScan 系統和熒光素酶報告基因實驗證實，ROS1基因是miR-760 的直接靶基因。為進一步確定miR-760 是通過介導靶基因ROS1，抑制肺癌細胞的增殖和遷移。將ROS1高表達質粒轉染入高表達miR-760 的A549 細胞中，發現異位表達的ROS1 促進A549 細胞的增殖，降低miR-760 抑制A549 細胞遷移的作用。這些結果最終證實，miR-760 通過靶向ROS1抑制NSCLC 的增殖和轉移。但至今為止，并沒有關于miRNAs 與ROS1基因重排的NSCLC 對克唑替尼耐藥的研究報道。因此，未來研究miRNAs 在肺癌細胞對ALK-TKIs 耐藥性中的作用，將有望成為治愈ALK 陽性和ROS1基因重排的NSCLC 的新靶點。

3 展望

近年來，隨著人們對肺癌分子生物學和基因組學的不斷深入研究，越來越多的新靶向治療藥物應用于肺癌，使肺癌的治療獲得很大的進步。但由于分子靶向藥物耐藥性的出現，肺癌仍然是全世界發病率和病死率最高的惡性腫瘤。然而，miRNAs 與肺癌治療進展和肺癌細胞耐藥性之間的復雜關系，為學者攻克分子靶向藥物耐藥性提供了幫助；為完善分子靶向治療和分子靶向藥物的開發，指明了新方向。目前，筆者在miRNAs 與肺癌治療進展和肺癌靶向藥物耐藥性方面的研究取得豐碩的成果，但仍然存在一些研究空白，比如miRNAs 在NSCLC 對ALK-TKIs 耐藥性的研究。這些研究的空白，是激勵學者不斷研究探索miRNAs奧秘的動力，揭秘miRNAs 在肺癌治療進展中的重要作用；同時也是ALK-TKIs 抗性NSCLC 患者治愈的希望。未來如何更好地利用具有逆轉耐藥性的miRNAs，抑制那些誘導靶向藥物耐藥性的miRNAs，是正確選擇個體化治療的重要一環；也是提高肺癌患者對靶向藥物利用率，減輕患者痛苦、延長患者生命的鑰匙。