表達禽流感病毒NP和M2融合基因重組乳酸菌的構建及鑒定

李瓊燕，楊桂連，張成賽，趙金輝，晉玉北，楊文濤，王春鳳

(吉林農業大學動物科學技術學院 吉林省動物微生態制劑工程研究中心，長春 130118)

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的疾病，無論是高致病性禽流感還是低致病性禽流感都需得到重視[1-2]，因為禽流感除了感染禽類，也能感染人、豬、犬等哺乳動物，甚至引起人類的死亡，被我國農業部列為甲類檢測傳染病[3]。禽流感對于禽類的影響包括上呼吸道感染、產蛋量和體重下降、精神沉郁，嚴重可導致死亡。禽流感疫病的傳播不僅嚴重損害我國養禽業的發展，同時危害到了人類的健康[2,4]。

流感病毒基質蛋白2(matrix protein2，M2)是存在于流感病毒表面的含量很少的跨膜蛋白之一，但其在被流感病毒感染的細胞表面大量存在[5]。它具離子通道功能，由胞外區、跨膜區和胞內區共同構成跨膜結構[6]。此外，M2蛋白在自1918年大流感爆發至今的各流行株中幾乎沒有出現變異，在各亞型間高度保守[5]。基于以上特點，M2蛋白成為流感通用疫苗的重要研究成分之一。

乳酸菌作為對機體有益的益生菌，擁有安全性高，容易培養的優點，是禽流感口服疫苗的理想載體[2]。乳酸桿菌是一種乳酸菌，保護性抗原基因或免疫調節因子良好的轉化或表達系統，可用作表達內源或外源蛋白的載體，在食品、保健、醫療等多種領域具有廣闊的前景[7]。植物乳桿菌(Lb.plantarumNC8)是從青儲飼料中分離的一種乳酸菌，與動物源的乳酸菌相比，它的抗逆性更強，適合作為宿主菌表達外源蛋白[2,8]。

本實驗旨在將AIV中的M2基因與載體pSIP409-pgsA′-NP連接構建重組質粒，然后制備重組乳酸菌，驗證其反應原性。

1 材料與方法

1.1 載體和菌株及主要試劑 質粒pSIP409-pgsA′-NP和pMD19-T-M2由吉林農業大學動物微生態研究室構建保存；Lb.plantarumNC8由印度卡馬拉杰大學Anbazhagan.K高級研究員惠贈；PCR反應試劑、無縫克隆試劑盒購自中美泰和生物技術(北京)有限公司、限制性內切酶XbaⅠ和HindⅢ、堿性磷酸酶和核酸分子量標準均購自Takara公司；凝膠回收及PCR產物純化試劑盒為美國OMEGA公司產品；PVDF轉移膜為Gleman公司產品；兔源H9N2亞型禽流感核蛋白NP單克隆抗體購自長春佳博新生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自長春鼎國生物技術公司；分子生物學實驗所用其他常用試劑均為進口或國產分析純產品。

1.2 引物的設計與合成 根據GenBank上登錄的M2基因序列，利用Primer5.0軟件設計一對引物，并在下游引物加入HindⅢ酶切位點。引物序列如下：P1：5'-TGAAGAATATGATAATGGTAGTGGTGGCGGTG-3'；P2：5'-CTGTAATTTGAAGCTTTCATTCCAATTCAATA-3'。上述引物送至吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.3 目的基因M2的擴增與回收純化 用pMD19-T-M2質粒為模版，以P1和P2為引物，PCR擴增M2基因。反應體系為10×ExTaq緩沖液2.5 μL，dNTP混合物2.5 μL，上下游引物各1.0 μL，pMD19-T-M2質粒1.0 μL，ExTaqDNA聚合酶0.5 μL，去離子水16.5 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個循環；最后72 ℃延伸7 min。取1 μL PCR產物加入到8 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。并按照DNA凝膠回收試劑盒操作說明書回收純化M2基因。

1.4 重組質粒的構建及鑒定 將純化回收的目的基因M2通過無縫克隆技術與載體pSIP409-pgsA′-NP進行連接，線性化載體pSIP409-pgsA′-NP由限制性核酸內切酶HindⅢ單酶切得到，此外，在NP基因與pSIP409-pgsA′相連接處包含XbaⅠ酶切位點。在離心管中加入線性化載體50 ng，3倍摩爾比于載體的目的基因，5 μL 2×Seamless Master Mix，ddH2O補到10 μL。混勻后在50 ℃反應15 min，然后將離心管放置于冰上。連接產物全量轉化至大腸桿菌TOP10感受態細胞中，涂布于含200 μg/mL EM的LB瓊脂平板上，37 ℃培養12 h。挑取單個菌落至5 mL含200 μg/mL EM的液體LB中，37 ℃培養12 h。培養后的菌液用質粒小提試劑盒提取質粒，各取2 μL質粒用凝膠電泳驗證。將有條帶的質粒進行XbaⅠ和HindⅢ雙酶切驗證。將陽性重組質粒送往吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。序列測定后應用NCBI上的Blast進行比較分析，將測序后的陽性質粒命名為pSIP409-pgsA′-NP-M2。

1.5 重組乳酸菌的制備 將Lb.plantarumNC8在MRS液體培養基中培養過夜，以1∶50的接種量轉移到MRS液體培養基中(含有20 g/L甘氨酸)，當OD600值至0.3時離心收集菌液并制備Lb.plantarumNC8感受態細胞。取5 μL重組質粒pSIP409-pgsA′-NP-M2與200 μL冰冷的乳酸菌感受態細胞混合，隨后移入到預冷的0.2 cm電擊杯中，置于冰上靜止5 min后電轉化。電轉條件為2000 V，400 Ω，25 μF。點擊結束后將電擊杯中的液體吸入到離心管中，同時加入600 μL 30 ℃預熱的含蔗糖的MRS恢復性液體培養基，30 ℃厭氧培養3 h。取100 μL菌液，涂布于含10 μg/mL EM的MRS瓊脂平板，30 ℃厭氧培養直到有單菌落出現為止。將疑似陽性菌落挑至含10 μg/mL EM的MRS液體培養基中30 ℃厭氧培養。以菌液為模板進行PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌命名為NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2。

1.6 重組乳酸菌誘導表達 將重組菌Lb.plantarumNC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2與NC8-pSIP409-pgsA′接到含紅霉素的MRS液體培養基中，30 ℃，厭氧條件下培養約12 h，按照1∶50體積接于新鮮的含紅霉素的MRS液體培養基中，30 ℃厭氧條件下培養至OD600值為0.3時加入SppIP(終濃度50 ng/mL)誘導培養，30 ℃厭氧條件下培養8 h停止。

1.7 流式細胞術 取200 μL誘導表達后的菌液離心收集菌體，加入100 μL含10 g/L血清的PBS，室溫孵育30 min后離心棄上清。以1∶40稀釋的兔源H9N2亞型禽流感核蛋白NP單克隆抗體為一抗，室溫孵育1 h后用PBS洗2次。以1∶100倍稀釋的山羊抗兔FITC為二抗，搖床室溫避光孵育1 h，用PBS洗2次后用350 μL PBS懸起。用流式細胞儀檢測，FlowJo 7.6軟件分析。

1.8 免疫熒光 取上述菌液3 μL菌懸液滴加在載玻片中央，蓋上蓋玻片置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.9 Western blot檢測 取5 mL菌液離心收集重組乳酸菌菌體，用PBS洗滌兩次，超聲破碎10 min后離心棄上清，最后懸在160 μL PBS中，加入40 μL 5×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，-20 ℃保存用于SDS-PAGE和Western blotting檢測。用10%SDS-PAGE凝膠進行電泳并按照《分子實驗克隆實驗指南》進行蛋白轉印。轉印后PVDF膜用50 g/L的脫脂奶粉常溫搖床封閉1 h，以1∶500稀釋的兔源H9N2型AIV NP單克隆抗體作為一抗，以1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG為二抗，最后用ECL顯色試劑盒顯色。

2 結 果

2.1 載體片段的確定 將質粒pSIP409-pgsA′-NP通過酶切得到線性化載體，經8 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析回收所得載體的條帶大約在7500 bp處觀察可得，與預期大小相符。

2.2 目的基因M2的擴增 以pMD19-T-M2為模版，用所設計的引物進行PCR擴增，經8 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結果顯示PCR擴增產物的條帶大約在300 bp處，與預期大小相符。

M:DNA分子質量標準；1：酶切產物M：DL10000 DNA Marker；1：Product of Restriction enzyme digestion圖1 載體pSIP409-pgsA′-NP凝膠電泳結果Fig 1 Results of carrier pSIP409-pgsA′-NP by gel electrophoresis

M：DNA分子質量標準；1:PCR擴增產物M: DL2000 DNA Marker ;1:Amplification products by PCR圖2 M2基因的PCR擴增結果Fig 2 Result of M2 gene by PCR

2.3 原核表達載體pSIP409-pgsA′-NP-M2的酶切鑒定 將載體與目的基因分別純化后通過無縫克隆的方法構建重組質粒pSIP409-pgsA′-NP-M2(圖3)。用XbaⅠ和HindⅢ將重組質粒進行雙酶切，經8 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結果可觀察到約6000 bp的pSIP409-pgsA′條帶與1800 bp的NP-M2基因條帶(圖4)，序列分析結果顯示與M2基因序列一致，說明目的基因已成功克隆于表達載體中。

M:DNA分子質量標準；1：重組質粒M: DL10000 DNA Marker; 1: Recombinant plasmid圖3 重組質粒pSIP409-pgsA′-NP-M2Fig 3 Enzymatic identification of recombinant plasmid pSIP409-pgsA′-NP-M2

M：DNA分子質量標準;1、2；重組質粒酶切鑒定M: DL10000 DNA Marker ;1,2: Enzymatic identification of recombinant plasmid圖4 重組質粒pSIP409-pgsA′-NP-M2的酶切鑒定Fig 4 Enzymatic identification of recombinant plasmid pSIP409-pgsA′-NP-M2

2.4 重組菌NC8-pSIP409-pgsA′-M2的PCR驗證

將重組質粒通過電轉化法轉入Lb.plantarumNC8感受態細胞中，將疑似陽性重組菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2進行PCR鑒定，在300 bp處觀察到條帶，與預期大小一致(圖5)。此外，序列分析結果顯示與M2基因序列一致，證明重組質粒成功轉化入Lb.plantarumNC8中。

M：DNA分子質量標準(10000Marker)；1：陰性對照；2：NC8- pSIP409-pgsA′-NP-M2M : DL10000 DNA Marker ; 1 : Negative control ;2 : NC8- pSIP409-pgsA′-NP-M2;圖5 重組乳酸菌的PCR鑒定Fig 5 Identification of recombinant lactic acid bacteria by PCR

2.5 重組乳酸菌的流式細胞術鑒定 用1.6所述方法對重組乳酸菌進行誘導表達，以兔源H9N2亞型禽流感核蛋白NP單克隆抗體為一抗，FITC標記的山羊抗兔IgG為二抗孵育誘導表達后的重組菌。以免疫H9N2亞型禽流感蛋白M2的小鼠血清為一抗，FITC標記的山羊抗鼠IgG為二抗孵育。用流式細胞儀檢測，FlowJo 7.6軟件分析。圖6結果顯示，重組乳酸菌錨定表達了目的蛋白，而轉入空載體的乳酸菌未檢測到目的蛋白。

2.6 免疫熒光驗證 上述菌液在熒光顯微鏡下觀察可見重組乳酸菌發綠色熒光，而轉入空載體的乳酸菌不發熒光(圖7)，提示重組乳酸菌錨定表達了目的蛋白。

圖6 重組乳酸菌流式細胞術檢測Fig 6 Detection of recombinant lactic acid bacteria by flow cytometry

圖7 重組乳酸菌免疫熒光鑒定Fig 7 Detection of recombinant bacteria by immunofluorescence experiments

2.7 Western-blot分析 用10%SDS-PAGE凝膠電泳產物進行蛋白印跡鑒定，在91.6 kD大小處出現一條蛋白印跡(圖8)，大小與預期相符，說明重組乳酸菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2表達的外源蛋白具有反應原性。

M：蛋白質分子質量標準；1：空載體表達產物；2: NP-M2基因在乳酸菌中誘導8 h的表達產物M: Protein molecular weight Marker；1：Expression product of pSIP409;2：Expression product of NP-M2 in Lb.plantarum NC8 for 8 h圖8 重組乳酸菌的Western-blot分析Fig 8 Western-blot analysis of recombinant gene NP-M2

3 討 論

H9N2亞型禽流感四季皆可流行，其傳播途徑很廣泛[9]。我國控制H9N2亞型AIV的傳播主要依靠滅活疫苗免疫，但研究顯示，使用AIV滅活苗免疫的雞群仍然發生H9N2亞型AIV的感染，并且感染病例呈現增加趨勢[10]。這一現象提示H9N2亞型AIV疫苗不能給雞群提供完全而有效的保護力[11]，研制新型有效疫苗以防控H9N2的傳播勢在必行。

目前商品化甲型流感疫苗，主要是以病毒表面的血凝素(hemagglutinin, HA)和神經氨酸酶(neuraminidase, NA)作為抗原成分[12]。但HA和NA易發生抗原漂移,而且甲型流感病毒亞型很多，各亞型病毒間不一定產生交叉保護作用，這給甲型流感的防制帶來極大的困難。AIV核蛋白NP在病毒中的蛋白質含量最高[13]，其存在于病毒體的內部，在基因轉移和變異方面也比較穩定。此外，研究表明基于M2抗原研制的疫苗免疫可產生抗體，引起特異性免疫[14]。NP和M2抗原序列保守，在不同亞型流感之間也具有較高的同源性，用以研究通用流感疫苗具有良好的前景。本實驗制備了融合表達AIV保守抗原NP和M2的重組乳酸菌，旨在研制預防AIV的廣譜型制劑。已經報道的數據顯示，NP-M2組合基因疫苗產生的保護作用遠比使用單基因疫苗效果好[15]，進一步研究發現，NP-M2e重組蛋白聯合佐劑通過肌肉注射能使機體產生細胞免疫和體液免疫[16]，但通過注射途徑免疫不僅費時費力，而且會使動物產生應激反應。然而，重組乳酸菌作為一種能夠通過口服途徑給藥的新型疫苗不僅具有安全、經濟、方便和無應激反應的優勢，還可以誘導粘膜免疫反應，更加有利于預防經呼吸道感染的病原體。

近年來，許多研究利用植物乳桿菌作為外源蛋白運載系統研制口服疫苗，但其表達的蛋白多分泌于胞內，在細胞壁的阻隔下會影響免疫效果。錨定基因pgsA來自于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，能將外源蛋白錨定在宿主菌表面[17]，該研究發現，與植物桿菌細胞內表達相比，外源蛋白展示在宿主菌表面能產生更強的免疫效果。本實驗利用截斷的錨定基因pgsA′將外源蛋白展示在宿主菌表面，通過流式細胞術和免疫熒光技術都已經證實外源蛋白可以展示宿主菌表面，這為下一步評價該重組乳酸菌的免疫效果奠定了重要基礎。