UHPLC-Q/TOF MS結(jié)合HPLC-DAD定性和定量分析硫酸黏菌素可溶性粉中的未知添加物

陸春波,包愛情,周芷錦,張航俊,陳慧華

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所,杭州 311101)

硫酸黏菌素收載于《中國獸藥典》2010年版[1]，屬于多肽類抗菌藥，是一種堿性陽離子表面活性劑，用于防治豬、雞革蘭氏陰性菌所致的腸道感染，如仔豬黃痢、仔豬白痢、仔豬副傷寒、雞白痢、雞大腸桿菌病等[2-3]?；前仿冗_(dá)嗪屬于磺胺類抗菌藥物，甲氧芐啶屬于抗菌增效劑[4]，二者合用可產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)抗菌效果，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較強(qiáng)抑制作用，用于豬、雞大腸桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌等感染，如仔豬白痢、仔豬黃痢、豬肺疫、禽霍亂、雞白痢、雞大腸桿菌病等[5]。硫酸黏菌素和磺胺氯達(dá)嗪的適應(yīng)癥較為相似。目前，為了嚴(yán)厲打擊獸藥制劑中非法添加的狀況，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了一系列的公告，制訂了硫酸黏菌素制劑中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹和阿托品的檢查方法[6-7]。但由于違規(guī)企業(yè)非法添加的手段越來越隱蔽，技術(shù)越來越高超，使用法定標(biāo)準(zhǔn)檢測時(shí)無法發(fā)現(xiàn)或者難以發(fā)現(xiàn)，僅用已發(fā)布的公告檢查也不能完全覆蓋[8-9]。已報(bào)道的獸藥非法篩查方法主要有液相法[10]和液質(zhì)法[11]。近年來，采用建立的超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-Q/TOF MS)的譜庫，針對可疑樣品進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)疑似添加物，并使用HPLC-DAD法進(jìn)行雙重確證和含量測定。本文通過一個(gè)實(shí)際樣品在檢測中發(fā)現(xiàn)的異常，提出存在未知添加物的懷疑，使用高分辨質(zhì)譜推斷確證添加物以及液相色譜定量測定添加物，并對非法添加的原因進(jìn)行了探討，以期為打擊獸藥非法添加提供理論方法與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 Agilent 1260高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；Agilent 1290-6550超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UHPLC-Q/TOF MS)，(美國Agilent公司)；超純水機(jī)(美國Millipore公司)；XS205 分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ-500E超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)。

甲醇(色譜純，美國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國恩科公司)；乙酸銨(分析純，陜西隴化工股份有限公司)；磷酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。磺胺氯達(dá)嗪鈉對照品購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量96.4%(按磺胺氯達(dá)嗪計(jì)為89.5%)，批號(hào)為H0221206；甲氧芐啶對照品購于中國食品藥品檢定研究院，含量99.9%，批號(hào)為100031-201205。黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，每1mg效價(jià)22782單位，批號(hào)為K0271305。硫酸黏菌素可溶性粉(批號(hào)20160602，標(biāo)示規(guī)格10%)為浙江省內(nèi)抽檢樣品。

1.2 試驗(yàn)條件

1.2.1 UHPLC-Q/TOF MS分析 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Waters Atlantis,150 mm×3.0 mm,3 μm)；流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為5 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序見表1，后運(yùn)行3 min；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜采用ESI源，掃描方式為正離子全掃描(ESI+)，毛細(xì)管電壓4.0 kV，干燥氣流速為15 L/min，溫度為350 ℃；鞘氣流速為12 L/min，溫度為350 ℃。一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為全掃描模式，掃描范圍：m/z100～1000 Da；采集速率為1.5 spectra/s。二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為目標(biāo)離子采集模式(Targeted MS/MS)，掃描范圍：m/z50～1000 Da；采集速率為2.5 spectra/s；碰撞能量為10、20、40 eV。采集數(shù)據(jù)時(shí)使用參比溶液對儀器質(zhì)量軸進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，參比離子為m/z121.0509和m/z922.0098。

1.2.2 HPLC-DAD分析 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (Agilent Eclipse XDB, 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相A為0.1%磷酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序：0～2 min，2%B；2～25 min，2%B～100%B；25～28 min，100%B；28～28.1 min，100%B～2%B；28.1～31min，2%B，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL，掃描波長：200～400 nm，記錄230 nm波長處色譜圖。

表1 梯度洗脫表Tab 1 Gradient elution table

1.3 溶液的制備

1.3.1 供試品溶液 精密稱取硫酸黏菌素可溶性粉0.1 g置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液約80 mL超聲溶解后，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為HPLC-DAD供試品溶液。精密量取上述溶液1 mL置10 mL量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，作為UHPLC-Q/TOF MS篩查和確證用供試品溶液。

1.3.2 對照品溶液 分別精密稱取磺胺氯達(dá)嗪鈉、甲氧芐啶對照品適量，用50%甲醇溶液溶解并定量稀釋制成含磺胺氯達(dá)嗪、甲氧芐啶為50 μg/mL的對照品溶液，用于HPLC-DAD驗(yàn)證；將上述溶液用50%甲醇溶液稀釋制成100 ng/mL的溶液，作為UHPLC-Q/TOF MS確證用對照品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 未知物的發(fā)現(xiàn) 照《中國獸藥典》2010年版一部對該樣品按照硫酸黏菌素可溶性粉采用微生物檢定法測定含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)該樣品的抑菌圈為虛圈(圖1)。且薄層色譜鑒別中樣品溶液未顯示與黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同的斑點(diǎn)(圖2)，因此，懷疑該樣品中可能有其他非法添加物。

2.2 未知物的推斷 使用UHPLC-Q/TOF MS對該樣品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，總離子流圖(total ion chromatogram，TIC)如圖3所示，TIC圖中在5.123和5.549 min有2處較大響應(yīng)，對響應(yīng)1和響應(yīng)2分別進(jìn)行質(zhì)譜提取，得到m/z291.1452和m/z285.0204兩處響應(yīng)明顯大于其他離子的離子(圖3)，在PCDL(MassHunter Workstation Personal Compound Database and Library)庫中進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)甲氧芐啶的[M+H]+與m/z291.1452匹配，匹配分?jǐn)?shù)為98.26，磺胺氯達(dá)嗪的[M+H]+與m/z285.0204匹配，匹配分?jǐn)?shù)為97.62，因此，初步推測兩者為甲氧芐啶和磺胺氯達(dá)嗪。

圖1 黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品的抑菌圈(B)Fig 1 the inhibition zone of (A) colistin reference substance and (B) sample

圖2 黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品的薄層色譜圖(B)Fig 2 the thin-layer chromatogram of (A) colistin reference substance and (B) sample

圖3 檢品總離子流圖(A)及響應(yīng)1質(zhì)譜提取圖(B)和響應(yīng)2質(zhì)譜提取圖(C)Fig 3 (A) Total ion chromatogram of the sample, (B) mass spectra extracted from response signal 1 and (C) mass spectra extracted from response signal 2

2.3 未知物的確證

2.3.1 UHPLC-Q/TOF MS確證 將供試品溶液，照1.2.1項(xiàng)中條件分別以m/z為285.0208和291.1452為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜采集(圖4～圖5)，另取磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶對照品溶液(100 ng/mL)在相同的條件下采集二級(jí)質(zhì)譜，對照品圖譜與樣品圖譜幾乎完全一致，匹配值高達(dá)98.21和97.58。添加的化合物確證為磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶。為進(jìn)一步增強(qiáng)質(zhì)譜信息的可信度，對裂解規(guī)律進(jìn)行了推導(dǎo)。

2.3.2 HPLC-DAD確證 將供試品溶液與對照品溶液色譜峰的保留時(shí)間(圖6)和光譜圖比對，并對峰純度檢查和光譜相似度進(jìn)行檢查來確證非法添加物。供試品溶液在1.2.2項(xiàng)條件下檢出2個(gè)較大的未知色譜峰，與該條件下磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶對照品溶液的保留時(shí)間一致，紫外光譜相似。供試品溶液和對照品溶液色譜峰的純度值均在998.6～999.6之間，大于純度閾值(990)，為單一物質(zhì)峰；光譜相似度檢查結(jié)果顯示：供試品溶液與對照品溶液色譜峰的光譜圖進(jìn)行匹配，匹配度均在998.5～999.5之間，高于匹配閾值(990)，可認(rèn)為是同一化合物。

2.4 未知物的含量測定 經(jīng)上述UHPLC-Q/TOF MS和HPLC-DAD雙重驗(yàn)證，確證樣品中含有磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶，照《中國獸藥典》2010版[1]一部收錄的復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉中的含量測定方法檢測磺胺氯達(dá)嗪鈉和甲氧芐啶，含量分別為65.4 mg/g(按磺胺氯達(dá)嗪計(jì)58.5 mg/g)和13.4 mg/g。

圖4 硫酸黏菌素可溶性粉中疑似化合物([M+H]+為m/z 285.0208)的二級(jí)質(zhì)譜圖及可能裂解規(guī)律Fig 4 MS /MS spectra of the suspected compound ([M+H]+ at m/z 285.0208) in colistin sulphate soluble powder and possible fragmentation pattern

圖5 硫酸黏菌素可溶性粉中疑似化合物([M+H]+為m/z 291.1452)的二級(jí)質(zhì)譜圖及可能裂解規(guī)律Fig 5 MS /MS spectra of the suspected compound ([M+H]+ at m/z 291.1452) in colistin sulphate soluble powder and possible fragmentation pattern

圖6 混合對照品溶液(50 μg/mL)(A)色譜圖和檢品色譜圖(B)Fig 6 Chromatogram of (A) mixed reference substances (10 μg/mL) and (B) the sample

3 討論與結(jié)論

3.1 UHPLC-Q/TOF MS色譜條件的優(yōu)化 此色譜系統(tǒng)為常規(guī)篩查非法添加藥物所用，考察流動(dòng)相組成對色譜峰的分離、靈敏度和離子化率的影響。通常選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相，對一般的化合物均能滿足要求，甲醇價(jià)格較低，故選擇甲醇。流動(dòng)相中加入適量甲酸，絕大多數(shù)的正離子源的離子化效率會(huì)有一定提高。流動(dòng)相中加入適量乙酸銨，適用于部分負(fù)離子源模式下的化合物檢測。參照文獻(xiàn)[9,12-14]，將本文的條件確定為最佳條件。

3.2 UHPLC-Q/TOF MS質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用磺胺氯達(dá)嗪鈉和甲氧芐啶對照品溶液(100 ng/mL)，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。通過一級(jí)質(zhì)譜掃描獲取目標(biāo)藥物的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜后發(fā)生斷裂或重排等現(xiàn)象，產(chǎn)生不同的質(zhì)核比的離子碎片，從而優(yōu)化碰撞能量和定性離子，并推導(dǎo)了可能裂解的機(jī)理。

3.3 非法添加的原因分析 該樣品薄層色譜鑒別發(fā)現(xiàn)并沒有標(biāo)示主成分的黏菌素，但采用微生物檢定法測定含量，又有非正常抑菌圈產(chǎn)生，因此，懷疑有處方外添加成分。經(jīng)UHPLC-Q/TOF MS和HPLC-DAD雙重確證，發(fā)現(xiàn)樣品中有磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶，且磺胺氯達(dá)嗪和甲氧芐啶的含量分別為58.5 mg/g和13.4 mg/g。與《中國獸藥典》2010年版一部收載的復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉中的規(guī)格(1000 g：磺胺氯達(dá)嗪鈉625 g與甲氧芐啶125 g)稀釋10倍接近，該樣品已經(jīng)不是簡單意義上的處方外非法添加，而是有意將低濃度的復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉當(dāng)做硫酸黏菌素可溶性粉出售，推測生產(chǎn)企業(yè)如此做法的可能原因?yàn)閮烧咴诠π陷^為相近，而復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉成本較低，因此，采用這種“頂替”來謀取利潤。

當(dāng)前獸藥行業(yè)仍不規(guī)范，處方外非法添加的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，且添加的成分不確定，像本文的例子甚至使用其他藥物來替代，值得引起監(jiān)管部門重視。本文從發(fā)現(xiàn)該批樣品的非法添加到建立UHPLC-Q/TOF MS篩查確證和HPLC-DAD雙重確證，發(fā)現(xiàn)非法添加的情況并對原因進(jìn)行了一定的探討，希望可以為有關(guān)部門打擊獸藥非法添加提供一定的思路。已經(jīng)發(fā)布的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部非法添加物檢查方法，為針對某些指定藥物的非法添加，包含藥物只有50余種。由于UHPLC-Q/TOF MS的篩查范圍更廣，可建立多達(dá)幾百甚至上千種藥物的一級(jí)譜庫和二級(jí)譜庫，因此，采用UHPLC-Q/TOF MS的篩查方法，對可能存在的非法添加物進(jìn)行較全面篩查、確認(rèn)，以期為今后獸藥的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供有力的技術(shù)支撐，進(jìn)而掌握獸藥質(zhì)量的真實(shí)情況。