肺泡灌洗液革蘭氏染色與內(nèi)毒素檢測對革蘭氏陰性菌呼吸機相關(guān)性肺炎快速診斷的比較研究

周紅衛(wèi)，黃志儉

（北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門市中醫(yī)院急診科ICU，福建 廈門 361009）

呼吸機相關(guān)性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）是重癥監(jiān)護病房患者最常見的醫(yī)院獲得性感染，病死率高達24%～50%[1]，其中革蘭氏陰性菌感染占70%[2]，故此快速診斷革蘭氏陰性菌呼吸機相關(guān)性肺炎尤為重要。傳統(tǒng)的病原學(xué)培養(yǎng)往往需要48～72 h，一旦發(fā)生VAP，經(jīng)驗常會采用廣譜抗生素治療，甚至過度治療，往往導(dǎo)致細菌耐藥和患者經(jīng)濟負擔(dān)加重。鑒于此，及時提供病原學(xué)的信息對指導(dǎo)抗生素的合理應(yīng)用是目前醫(yī)務(wù)工作者亟需解決的難題。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 為2014年10月至2016年1月入住本院綜合ICU需有創(chuàng)機械通氣的成人患者，VAP的診斷依據(jù)美國胸科學(xué)會、美國傳染病學(xué)會對于VAP臨床診斷標準［3］。排除標準：肺部有原發(fā)性感染、全身慢性疾病（結(jié)核、腫瘤等）、因非VAP原因死亡、放棄治療、無法獲得知情同意書者。最終有65例納入本研究，其中男44例（64.62%），女21例（35.38%），平均年齡（49.91±17.86）歲。入選患者中，重型顱腦26例，腦出血15例，重癥胰腺炎2例，多發(fā)傷15例，心肺復(fù)蘇術(shù)后4例，重癥哮喘2例，重癥肌無力1例。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗的方法 患者在24小時內(nèi)發(fā)現(xiàn)符合VAP診斷標準者，患者術(shù)前禁食2 h，監(jiān)測心率、血壓、經(jīng)皮血氧飽和度（SpO2），調(diào)整呼吸機模式為控制通氣，呼吸末正壓（PEEP）為10 cmH2O，吸入氧濃度（FiO2）為100%，肺泡灌洗前給予丙泊酚或咪達唑侖鎮(zhèn)靜。使用PENTAX FB-15BS支氣管鏡經(jīng)氣管插管接三通管由活瓣密閉端進入主氣管，依據(jù)胸片或CT片引導(dǎo)插入感染肺段，從活檢孔注入37℃生理鹽水行支氣管肺段灌洗，注入50 ml，用負壓吸引回收至除去熱源的器皿中-70℃保存，若病變?yōu)閺浡曰蛴跋駥W(xué)無滲出病變時，可灌右中葉或右下葉。灌洗過程中如SpO2降至85%立即停止操作，退鏡后待SpO2恢復(fù)至90%以上再行灌洗。肺泡灌洗并送細菌培養(yǎng)+藥敏，革蘭氏染色。

1.2.2 分組 根據(jù)病原學(xué)結(jié)果，將患者分為革蘭氏陰性桿菌感染組（A組），非革蘭氏陰性桿菌感染組（B組）；根據(jù)肺泡灌洗液中革蘭氏染色結(jié)果和內(nèi)毒素水平將患者分為革蘭氏染色陰性菌組（C組）和內(nèi)毒素水平≥6 EU/ml組（D組）。

1.2.3 肺泡灌洗內(nèi)毒素的檢測方法 檢測前將肺泡灌洗液融化，用離心機以1 800轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,采用鱟試劑的顯色基質(zhì)法，根據(jù)標準曲線，依據(jù)吸光度檢測肺泡灌洗液中內(nèi)毒素的含量，檢測試劑及設(shè)備均由廈門市鱟試劑廠提供。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以“±s”表示，兩組間計量資料的比較采用t檢驗的方法，兩組間計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特診曲線（ROC）分析內(nèi)毒素的靈敏度和特異度，曲線下面積，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

最終有65例患者納入本研究，其中A組51例，B組14例,C組33例，D組50例；A組中，病原學(xué)為銅綠假單胞菌23例（45.10%），鮑曼不動桿菌15例（29.41%），大腸埃希氏菌5例（10.00%），肺炎克雷伯菌3例（5.88%），嗜麥芽窄食單胞菌3例（5.88%），洋蔥伯克霍爾德菌2例（3.92%）；B組中病原學(xué)為耐甲氧西林的葡萄球菌（MRSA）6例（其中2例合并真菌感染）（42.86%），耐甲氧西林的表皮葡萄球菌（MRSE）3例（21.43%），凝固酶陰性的葡萄球菌（MRCNS）2例（14.29%），對甲氧西林敏感的葡萄球菌（MSSA）2例（14.29%），MSSA合并真菌混合感染1例（7.14%）。

A組與B組白細胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、APACHⅡ評分及性別比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義；A組肺泡灌洗液中內(nèi)毒素水平顯著高于B組（P＜0.05）；C組中革蘭氏陰性菌VAP患者24例，D組中革蘭氏陰性菌VAP患者46例，D組中革蘭氏陰性菌VAP所占的比例顯著高于C組（P＜0.05）；ROC曲線分析表明，以≥6 EU/ml為界點，肺泡灌洗內(nèi)毒素檢測革蘭氏陰性桿菌膿毒血癥的靈敏度95.9%，特異度68.7%，陽性預(yù)測值92.0%，陰性預(yù)測值77.78%,曲線下面積為0.857（P＜0.05）,95%可信區(qū)間為0.721～0.993，見表1和表2，圖1。

表1 A組與B組BALF中內(nèi)毒素及相關(guān)實驗參數(shù)的比較情況Table 1 Comparison of endotoxin and related experimental parameters in BALF between groupAand group B

表2 C組與D組革蘭氏陰性菌VAP所占比率的比較情況Table 2 Comparison of VAP ratio of gram negative bacteria in group C and group D

圖1 BALF中內(nèi)毒素的ROC曲線Figure 1 ROC curve of endotoxin in BALF

3 討論

VAP是ICU患者最常見的院內(nèi)感染性疾病，一旦發(fā)生VAP，患者的預(yù)后將顯著惡化。早期快速診斷對于改善VAP患者預(yù)后是至關(guān)重要的。但是VAP的快速診斷一直是危重醫(yī)學(xué)科面臨的一個挑戰(zhàn)。

革蘭染色是細菌學(xué)最常用的一種鑒別染色方法，此染色法將細菌分為兩大類，可能有助于鑒別細菌及治療時選擇適當(dāng)?shù)目咕幬铮嬖谥^大的爭議性。Bouza等［4］研究認為，由于微生物的鑒定和藥物敏感性試驗通常需要3～4 d，但臨床實踐中臨床醫(yī)生需要有用而快速的信息，即使部分或者不太完善，顯然仍比一個完美但延遲的報告好很多，其中革蘭染色就是一個直接的能夠指導(dǎo)治療并且與最終的培養(yǎng)結(jié)果有著合理相關(guān)性的實驗診斷方法，因此，革蘭染色是VAP快速診斷的有效方法。Uehara等［5］研究表明革蘭染色的結(jié)果直接影響著抗生素的選擇，從而影響患者的病死率。但也有研究表明革蘭氏染色法準確度有很大的變異性，主要是由于菌種的菌齡、細菌得堆積密度、碘液媒染時間和乙醇溶液脫色時間等因素均會影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性。Croce等[6]給232例患者行443次肺泡灌洗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，革蘭氏染色在80%的革蘭氏陽性菌VAP及40%的革蘭氏陰性菌VAP患者中發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌，在52%的革蘭氏陽性菌VAP和77%的革蘭氏陰性菌VAP患者中發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌。B Allaouchichede等[7]研究及近期一薈萃分析[8]均發(fā)現(xiàn)，革蘭氏染色法雖有助于診斷早期VAP，但并不能有效的用于區(qū)分病原體，指導(dǎo)抗生素的使用。

在我們的研究中，51例革蘭氏陰性菌VAP患者中只有64.71%患者革蘭氏染色為陰性菌，37例革蘭氏染色為陰性菌患者中只有72.73%患者為革蘭氏陰性菌VAP，27.27%革蘭氏陽性VAP患者革蘭氏染色為陰性菌，14例革蘭氏陽性菌VAP中64.29%的患者革蘭氏染色為陰性菌。從我們研究結(jié)果表明革蘭氏染色不能有效的區(qū)分VAP患者的病原體，從而指導(dǎo)抗生素的應(yīng)用。

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌胞壁結(jié)構(gòu)中的脂多糖,脂多糖經(jīng)細菌胞壁合成后被轉(zhuǎn)運到細胞表面構(gòu)成胞壁外膜的組成成分，故此通過內(nèi)毒素檢測可判斷是否有革蘭氏陰性菌感染[9]。在我們的研究中通過檢測肺泡灌洗中內(nèi)毒素水平發(fā)現(xiàn)，以≥6 EU/ml為界點，肺泡灌洗液內(nèi)毒素檢測革蘭氏陰性桿菌膿毒血癥的靈敏度95.9%，特異度68.7%，陽性預(yù)測值92.0%，陰性預(yù)測值77.78%,是一種快速診斷革蘭氏陰性菌VAP的有效方法。分組中，革蘭氏陰性菌VAP患者肺泡灌洗液內(nèi)毒素水平顯著高于革蘭氏陽性球菌組，也充分說明肺泡灌洗液中內(nèi)毒素對快速鑒別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性球菌有較好作用。我們的研究結(jié)果與國外一些相關(guān)研究[10-12]有非常相似的一致性。

肺泡灌洗液內(nèi)毒素檢測與革蘭氏染色法相比，BALF中內(nèi)毒素水平≥6 EU/ml患者中革蘭氏陰性菌VAP所占的比例顯著高于革蘭氏染色為陰性菌的患者。這表明，BALF中內(nèi)毒素檢測對診斷革蘭氏陰性菌VAP作用顯著優(yōu)于革蘭氏染色法。我們的研究也存在一定局限性，如一些VAP患者在行肺泡灌洗前已經(jīng)經(jīng)驗使用抗生素，對肺泡液中內(nèi)毒素水平檢測有一定的影響；其次，一些VAP患者合并真菌感染，有研究發(fā)現(xiàn)[13-14]念珠菌細胞壁上的β-葡聚糖，通過活化G因子可產(chǎn)生凝集反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測假陽性，對研究結(jié)果也有一定的干擾；再者我們的樣本量有限，肺泡灌洗不是采用保護性肺泡灌洗的方法，保本采集存在一定的污染，對內(nèi)毒素檢測也有一定的影響，有待改進。

目前，國內(nèi)各個醫(yī)院ICU中基本都配備有纖維支氣管鏡，而且肺泡灌洗方法簡單易行，內(nèi)毒素檢測快捷經(jīng)濟，故此，通過BALF中內(nèi)毒素檢測是一種快速、簡便、經(jīng)濟、有效的診斷革蘭氏陰性菌VAP的方法，而且對指導(dǎo)抗生素的應(yīng)用有一定的作用，值得廣泛推廣應(yīng)用。