冰片對丹參脂溶性藥效成分促吸收作用研究*

周陸怡，魯澄宇

（廣東醫科大學藥學院，廣東 東莞 523808）

丹參Salvia miltiorrhizaBeg.為唇形科植物丹參的干燥根，具有擴張冠脈、增加冠脈血流量、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循環、保護心臟等作用［1］。二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA是丹參脂溶性的主要活性成分［2-3］。冰片為常用的中藥促吸收劑，可促進藥物吸收和促進血腦屏障開放［4］，提高其他藥物的生物利用度［2］。丹參總酮難溶于水［5］、口服難吸收［6］、生物利用度低［7-8］、不易透過血腦屏障［9-10］的特點，極大地限制了丹參酮類藥物制劑的臨床應用。目前，國內外針對冰片促進血腦屏障開放的作用進行了研究［11］，但鮮有冰片同時對多種丹參脂溶性藥效成分在體內組織分布的影響研究。本研究中探討了冰片同時對多種丹參脂溶性藥效成分促吸收和組織分布的影響，從藥物代謝動力學的角度闡明使藥冰片對君藥丹參的協同增效作用，為指導開發易吸收、生物利用度高的口服型丹參制劑提供參考。

1 儀器、試藥及動物

儀器：Agilent1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；可調式微量移液器（德國 eppendorf公司）；eppendorf5417r型高速冷凍離心機（德國eppendorf公司）；auy120型電子天平（日本shimadzu公司）；真空采血管肝素抗凝管（君威醫療設備有限公司）。

試藥：丹參醇提物（西安鴻生生物技術有限公司，批號為20121107）；冰片（分析純，湖南株洲林化廠，批號為201208）。甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；生理鹽水（湖北興華制藥有限公司）；二氫丹參酮Ⅰ（批號為 A0060）、隱丹參酮（批號為110852-200806）、丹參酮Ⅰ（批號為 110867-200406）和丹參酮ⅡA（批號為110766-200619）對照品，丙酸睪酮（內標，批號不100008-201206）均購自中國食品藥品檢定研究院。

動物：SPF 級 SD 大鼠，雄性，體質量（220±10）g，20只，由廣東省實驗動物中心提供，動物合格證號為scxk（粵）2015-0007，健康狀況良好。實驗方法和目的符合人類道德倫理標準，實驗過程中對動物的處置符合2006年科學技術部發布的關于善待實驗動物的指導性意見。

2 方法與結果

2.1 給藥方法與樣品采集

SD大鼠隨機分成2組，每組10只，實驗前12 h禁食，自由飲水。冰片組灌胃丹參醇提物混懸液100 mg／kg，然后立即灌胃冰片100 mg／kg；未加冰片組灌胃丹參醇提物混懸液100 mg／kg，然后立即灌胃乙醇 1 mL／kg。灌胃30 min后處死大鼠，取血液、腦和心臟，待處理。

2.2 生物樣品處理

取血液，以3 000 r／min離心10 min分層，取淡黃色上清液即血漿0.5 mL，加入50 μL甲醇，加入內標溶液5 mg／L的丙酸睪酮內標溶液50 μL，渦旋混合器混旋 1 min，3 000 r／min離心 5 min，將上清液轉移離心試管中，加入2.5 mL（5倍體積比）乙酸乙酯，渦旋1 min，3 000 r／min離心5 min分層，吸取上層有機相，30℃水浴下氮氣，吹干。殘渣用100 μL流動相溶解，渦旋1 min，13 200 r／min 高速離心 10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾后進樣 20 μL。

取腦組織或者心臟組織，加入1∶5（g／mL）的質量體積比的生理鹽水，加入50 μL甲醇，加入內標溶液5 mg／L的丙酸睪酮內標溶液50 μL，勻漿，渦旋混合器混旋1 min，3 000 r／min離心5 min，將上清液轉移離心試管中，加入5倍體積質量比的乙酸乙酯，渦旋1 min，3 000 r／min離心5 min分層，吸取上層有機相，30℃水浴下氮氣吹干。殘渣用100 μL流動相溶解，渦旋1 min，13 200 r／min 高速離心 10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾后進樣 20 μL。

2.3 測定方法的建立

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：水 - 甲醇（22 ∶78）；流速：0.8 mL ／min；檢測波長：244 nm（二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ和丙酸睪酮），266nm（隱丹參酮和丹參酮ⅡA）；柱溫：25℃。

2.3.2 溶液制備

取二氫丹參酮Ⅰ對照品2.90 mg，隱丹參酮對照品8.40 mg，丹參酮Ⅰ對照品 3.30 mg，丹參酮ⅡA對照品8.60 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL，即得對照品的混合貯備液。精密吸取混合貯備液各1 mL，用甲醇定容至10 mL，即得二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA質量濃度分別為 29.0，82.9，33.0，86.0 mg／L的混合標準溶液，以此混合標準溶液為起始溶液，用甲醇以1∶1的比例逐級稀釋得到各個系列質量濃度的標準溶液（見表1）。另精密稱取5.0 mg丙酸睪酮對照品，甲醇定容至10 mL，即得質量濃度為0.50 g／L的丙酸睪酮貯備液，用甲醇稀釋100倍，即得質量濃度為5 mg／L的丙酸睪酮內標液。

表1 各對照品溶液的系列質量濃度

2.3.3 方法學考察

標準曲線制備：精密量取空白血清和皮膚樣品，加入不同質量濃度2.2.2項下各標準溶液50 μL，內標溶液丙酸睪酮50 μL，按2.2項下方法進行處理并測定。以各對照品峰面積與內標物峰面積的比值（Y）為縱坐標、對照品質量濃度（X）為橫坐標，用最小二乘法進行線性回歸，分別得到血漿、腦組織和心臟組織中各丹參脂溶性成分的標準曲線。結果見表2。

準確度和精密度試驗：按照精密度的測定方法，配制高中低3個質量濃度的對照品溶液，按生物樣品處理方法制備，加入不同質量濃度的二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA，測定。結果見表3。

表2 血漿、大腦、心臟組織中4種藥效成分的標準曲線及線性范圍

專屬性試驗：按擬訂色譜條件，測得血漿、腦組織和心臟組織中的內源性物質均不能干擾二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和內標物的測定。以血漿為例，色譜圖見圖1。二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、內標丙酸睪酮和丹參酮ⅡA的保留時間tR分別為10.4，15.6，17.0，24.0，25.5 min，各被測成分峰與雜質峰分離良好。二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、內標丙酸睪酮和丹參酮ⅡA分離度均大于1.5。于244 nm檢測波長下，腦勻漿液中的其他成分不影響二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ和內標丙酸睪酮的含量測定；于266 nm檢測波長下，腦勻漿液中的其他成分不影響隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量測定；另外，按二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、內標丙酸睪酮和丹參酮ⅡA峰計理論板數均大于10 000。

萃取回收試驗：分別制備低、中、高3個質量濃度的血漿、腦組織和心臟組織的標準溶液，按樣品預處理和測定方法操作，得峰面積比與相應質量濃度對照品溶液進樣測得的峰面積比進行比較，計算回收率，重復測定3次。由表4可知，血漿和腦組織勻漿液中各成分的萃取回收率均大于50%，RSD均小于15%；心臟組織勻漿液中各成分的萃取回收率相對較低，RSD均小于6%。表明萃取過程比較穩定，方法穩定性好，回收率較好。

2.3 丹參各脂溶性成分血藥濃度和組織濃度分析

按2.2項下方法操作，得到冰片組血漿樣品，可明顯檢測到隱丹參酮，而未加冰片組血漿樣品中未檢測到隱丹參酮；冰片組心臟組織樣品中隱丹參酮的峰高明顯比未加冰片組心臟組織樣品中隱丹參酮的峰高要高。另外，兩組的腦組織樣品中均未檢測到隱丹參酮，所有生物樣品里均未檢測到二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA。由于10個樣本中隱丹參酮與內標物峰面積比值很小，不在線性范圍以內，故無定量計算。色譜圖見圖2。可見，加入冰片后隱丹參酮峰高1.81，加入冰片后隱丹參酮峰高2.29，加入冰片后隱丹參酮峰高 1.22。

表3 血漿、大腦、心臟組織中4種藥效成分精密度試驗結果和方法回收率（n=3）

圖1 血漿樣品中丹參各脂溶性成分分析方法的專屬性試驗高效液相色譜圖

表4 萃取回收試驗結果（%，n=3）

3 討論

3.1 給藥方案選擇

本試驗采用灌胃，嘗試了不同的給藥方案，從最初灌胃大鼠人體等效給藥劑量0.3 g／kg復方丹參片，到灌胃7.5 g／kg復方丹參片，均未檢測到各被測組分；還嘗試了多次給藥，每8 h給藥1次，連續給藥8次，也未檢測到各被測組分；考慮到各被測組分均為脂溶性成分，與油脂同服可能會增加藥物的吸收，還嘗試了灌胃給藥復方丹參片混懸液后立即灌胃一定量的食用調和油，也未檢測到各被測組分。0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶解丹參醇提物灌胃給藥時，依然沒有檢測到各被測組分；乙醇-甘油-水（20∶20∶60）的混合溶劑溶解丹參醇提物灌胃給藥時，未檢測到各被測組分；最后，用1，2-丙二醇溶解丹參醇提物灌胃給藥，也只能在血漿和心臟樣品中檢測到極微量的隱丹參酮。結果表明，二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA口服生物利用度較低，其溶解釋放過程可能是影響吸收的限制因素，提示藥劑工作者應從增加藥物的溶解性著手，如將其制成固體分散片或β-環糊精包合物等劑型來提高其口服生物利用度，或者直接通過開發新的給藥途徑來研制相應的新劑型。

3.2 脂溶性成分血藥濃度和組織濃度分析

通過分析冰片組和未加冰片組生物樣品色譜圖中隱丹參酮的峰高或峰面積，冰片組血漿和心臟組織樣品中隱丹參酮的峰高明顯比未加冰片組血漿和心臟組織樣品要高，證實在血漿和心臟組織中冰片確實可促進隱丹參酮的吸收［12］。為研究隱丹參酮發揮擴張冠脈、增加冠脈血流量、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循環、保護心臟的藥效物質基礎提供了科學的依據。

3.3 丹參各成分在腎臟組織藥物濃度分析

在丹參治療骨質疏松研究［13-15］基礎上，本研究中設計了測定腎臟組織中的藥物濃度，進一步研究丹參脂溶性成分的代謝排泄情況及在治療骨質疏松方面發揮的作用。但在建立腎臟樣品中丹參各脂溶性成分含量測定的標準曲線試驗過程中，發現擬采用的內標丙酸睪酮的峰面積很不穩定，所建立的標準曲線線性很差。分析原因，可能是甾體激素丙酸睪酮與腎臟組織勻漿液中的內源性成分有一定的相互作用，從而造成內標的萃取不完全。試驗過程中也檢測了部分腎臟樣品，均未檢測到被測組分，提示丹參脂溶性成分通過腎臟的排泄量會很少，丹參水溶性成分丹參素可發揮治療骨質疏松［13］。

1.隱丹參酮 2.丙酸睪酮A.未加冰片組血漿樣品 B.冰片組血漿樣品 C.未加冰片組心臟樣品 D.冰片組心臟樣品

3.4 小結

丹參含有水溶性和脂溶性成分，以往研究中已證實丹參水溶性成分無法通過血腦屏障［14］。本研究中所有的丹參脂溶性成分在腦組織中均未檢測到，實測藥物濃度在分析方法的定量限以外，由于口服生物利用度低的原因，應提高灌胃丹參醇提物混懸液的量，或者更換給藥方式選擇注射給藥［16］，以此優化試驗方法來研究冰片丹參脂溶性成分的促吸收研究。