紫草素誘導卵巢癌SKOV3和A2780細胞壞死性凋亡的作用及其機制研究

馮 偉，馬建文，饒梅冬 △

（1.新疆維吾爾自治區烏魯木齊市婦幼保健院，新疆 烏魯木齊 830001； 2.新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830001）

卵巢癌發病率居女性生殖系統惡性腫瘤第3位，但死亡率遠遠超過其他任何一種婦科惡性腫瘤，位居第1位［1］。其主要原因是發病隱匿，早期癥狀不明顯，缺乏有效的早期診斷方法，60%～70%的患者確診時已屬晚期，5年生存率僅30%［2］。傳統的化學治療（簡稱化療）藥物主要細胞毒性類藥物，其作用機制主要依賴于腫瘤細胞與正常細胞生長、修復、死亡動力學等之間的差異，往往缺乏特異性［3］。因此，選擇性殺死腫瘤細胞而減少對正常組織的損傷作用是惡性腫瘤化療的新挑戰。紫草素（shikonin）是一種由草本植物紫草根部衍生而來的萘醌化合物，具有良好的抗炎和抗菌活性，用于治療燒傷、皮膚病和喉嚨疼痛等［4］；還具有顯著的抗腫瘤活性，如誘導肝癌細胞凋亡、抑制黑色素瘤的增殖、殺死白血病細胞等［5-6］。其抗腫瘤作用機制與誘導腫瘤細胞的凋亡（apoptosis）和壞死性凋亡（necroptosis）有關，且在引起腫瘤細胞凋亡和壞死性凋亡過程中活性氧（ROS）的過量產生往往有著重要作用［7-8］。作為一種細胞程序性死亡方式，壞死性凋亡跟多種抗腫瘤藥物的作用機制相關［9］。本研究中探討了紫草素對人卵巢癌細胞SKOV3和A2780增殖的影響及可能的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：BX53型熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；BD FACSVia型流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）。

試藥：MEM培養基、胎牛血清均購于美國Hyclone公司；紫草素（純度≥98%，批號為S7576，規格為10 mg），二甲基亞砜（DMSO，純度≥99.7%，批號為D2650-5X，規格為 5 mL），Hoechst 33342（純度≥98.0% ，批號為B2261，規 格 為 25 mg），PI（純 度 ≥ 98.0% ，批 號 為04511-1KT-F），受體相互作用蛋白激酶 1（RIP1）抑制劑（Nec-1，純度≥98.0% ，批號為 SML1990，規格為5 mg），N-乙酰 -L-半胱氨酸（NAC，純度≥98.0%，批號為 1009005，規格為 200 mg），PI-Annexin V-FITC 試劑盒（批號為 APOAF-20TST）和 2′，7′- 二氯熒光黃雙乙酸鹽 （DCFH-DA）熒光探針（純度≥97.0% ，批號為D6883，規格為50 mg），均購于美國Sigma公司；小鼠抗人單克隆RIP1和RIP3抗體（美國Abcam公司），小鼠抗人單克隆β-Actin抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；Cy3標記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體（二抗，中國中山金橋生物技術公司）。

細胞：人卵巢癌細胞SKOV3（編號為HTB-77）和A2780（編號為C0049），人正常卵巢上皮細胞IOSE80（編號為C1390），均購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 方法

細胞培養和分組：將 SKOV3，A2780，IOSE80細胞置MEM培養液中，其培養基中含10%胎牛血清、鏈霉素100 U／mL和青霉素100 U／mL，在5%CO2及37℃條件下培養。待細胞鋪滿瓶壁70% ～80%時，再以胰蛋白酶消化傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。IOSE80細胞只進行不同濃度紫草素處理后細胞活性的檢測。按SKOV3細胞和A2780細胞分為對照組、紫草素組、NAC預處理合并紫草素組和Nec-1預處理合并紫草素組。紫草素組加用不同濃度的紫草素處理；NAC預處理合并紫草素組先使用1 nmol／L的NAC預處理2 h，離心，換液，然后用 5 μmol／L 紫草素處理 24 h 后檢測；Nec-1預處理合并紫草素組先使用100 μmol／L的 Nec-1 預處理 2 h，離心，換液，然后用 5 μmol／L 紫草素處理24 h后檢測。

四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞增殖：取已準備好的單細胞懸液，以5×105個／mL的密度接種于96孔培養板，每孔100 μL，每組設5個復孔。標準條件培養過夜后，于48 h加入新的含紫草素的培養液，紫草素每孔終濃度分別為 2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0 μmol／L，對照組不加藥物（只含等量培養基），每組細胞均培養24 h后加入20 μL 5 g／L的MTT溶液處理，培養結束后，加入 150 μL DMSO，避光振蕩 10 min，置酶標儀于492 nm波長處檢測各孔吸光度，計算增殖抑制率。另外，不同時間的實驗選擇紫草素的濃度為6.25 μmol／L，分別處理 6，12，18，24，30，36 h，其他實驗步驟同上。存活率 =A處理組／A對照組×100%。

流式細胞術檢測細胞壞死性凋亡：將細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后重懸于Binding Buffer，然后加入 5 μL的 Annexin V-FITC 染色，混勻，再加入 5 μL PI，混勻，室溫避光反應10 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

Hoechst 33342和PI染色觀察細胞形態：將對數期細胞按每孔1×105個置預先置入玻璃蓋玻片的6孔培養板中，每孔加細胞懸液2 mL，24 h后給藥，再孵育24 h后吸盡培養液，PBS洗2遍，每孔加入1 mL固定液［甲醇 - 冰醋酸 （3 ∶1）］，固定 15 min，去除固定液，用PBS 洗 2 遍，加入 10 μg／L的 Hoechst33342，染色 10 min，用 PBS 洗 2 遍，再加入 10 μg／L 的 PI，染色 10 min，用PBS洗2遍，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態。

活性氧測定：采用DCFH-DA熒光探針測定。不同濃度紫草素處理細胞后，取對數生長期細胞并調整細胞濃度至 1～10×106個 ／mL，加入終濃度為 10 μmol／L的 DCFH-DA，37℃及 5%CO2培養箱中靜置0.5 h，每隔3～5 min混勻1次，使探針和細胞充分作用。用溫暖的PBS洗滌細胞3次，去除未進入細胞內的DCFH-DA，最后收獲各組細胞，采用流式細胞術測量DCF熒光強度。

蛋白質印跡（Western Blotting）法檢測：取對數生長期細胞接種于培養瓶，離心，棄培養液，加入RIPA細胞裂解液裂解30 min，BCA法測定裂解液中的蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，TBST漂洗，將PVDF膜置含有RIP1，RIP3，β-Actin對應單克隆抗體一抗中（1∶1 000），4℃冰箱孵育，過夜，用TBST漂洗，再與Cy3標記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體（1∶5 000）室溫孵育2 h，漂洗后，用Tanon 5500型凝膠成像系統拍照，并分析蛋白產物條帶的相對光密度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 抑制卵巢癌細胞增殖

結果見圖 1。不同濃度紫草素處理24 h后，對SKOV3和A2780細胞的增殖均有明顯的抑制作用，且呈現一定劑量的依賴性，半數抑制濃度（IC50）分別為6.25 μmol／L 和 10.0 μmol／L；對 IOSE80 細胞的增殖無顯著的抑制作用。6.25 μmol／L紫草素處理不同時間后，對SKOV3和A2780細胞的增殖均有明顯的抑制效應，且呈現時間依賴性。

圖1 紫草素對卵巢癌細胞增殖的影響（X ± s，n=3）

2.2 誘導卵巢癌細胞壞死性凋亡

結果見圖 2 和圖 3。可見，5 μmol／L 和 10 μmol／L 紫草素處理后，SKOV3和A2780細胞的早期凋亡率（Annexin V+／PI-細胞）無明顯變化，而 PI+細胞和Annexin V+／PI+細胞的比例明顯增加，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。進一步使用Hoechst 33342和PI染色進行定性分析，結果見圖4。PI+細胞無明顯細胞凋亡特征，說明Annexin V+／PI+細胞不是晚期凋亡的細胞，PI+細胞和Annexin V+／PI+細胞主要是壞死性凋亡的細胞。提示紫草素誘導SKOV3和A2780細胞壞死性凋亡呈劑量和時間依賴性。

圖2 紫草素誘導卵巢癌細胞Annexin V-FITC／PI雙染色流式分析結果

圖3 紫草素誘導卵巢癌細胞壞死性凋亡定量分析（X ± s，n=3）

圖4 紫草素誘導卵巢癌細胞調亡Hoechst 33342和PI染色定性分析結果（×200）

2.3 誘導卵巢癌細胞活性氧產生

使用DCFH-DA熒光探針檢測紫草素誘導卵巢癌細胞活性氧的產生。由圖 5 可見，5 μmol／L 或 10 μmol／L紫草素處理后，可明顯誘發SKOV3和A2780細胞活性氧的產生，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖5 紫草素誘導卵巢癌細胞活性氧相對量（X ± s，n=3）

2.4 卵巢癌細胞RIP1和RIP3蛋白的表達

結果見圖 6 和圖 7。5 μmol／L 和 10 μmol／L 的紫草素處理后，可明顯上調壞死性凋亡相關蛋白RIP1和RIP3的表達，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 紫草素誘導卵巢癌細胞RIP1和RIP3蛋白表達的定性分析

2.5 NAC和Nec-1的影響

結果見圖8和圖9。當預先使用NAC或Nec-1預處理后，再使用 5 μmol／L的紫草素誘導 SKOV3和A2780細胞時，抑制劑預處理組SKOV3和A2780細胞的壞死性凋亡率（PI+細胞和Annexin V+／PI+細胞）明顯下降，相比紫草素組（5 μmol／L），差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

植物中通常含有多種抗腫瘤成分，且許多植物提取物已用于治療癌癥，如長春新堿、紫杉醇、拓撲替康，紫草素是一種從中草藥植物中提取的活性化合物。其安全性和有效性已得到了肯定，尤其在婦科腫瘤如宮頸癌［10］和乳腺癌［11］中的抗腫瘤作用。李紅英等［12］的研究發現，紫草素可促使卵巢癌HO-8910細胞樹突狀細胞的成熟，從而刺激機體產生特異性的抗腫瘤免疫。

圖7 紫草素誘導卵巢癌細胞RIP1和RIP3蛋白表達的定量分析（X ± s，n=3）

圖8 NAC，Nec-1對紫草素誘導卵巢癌細胞Annexin V-FITC／PI雙染色流式分析結果

本研究中發現，紫草素以劑量和時間依賴的方式抑制人卵巢癌SKOV3和A2780細胞的增殖，對于人正常卵巢上皮IOSE80細胞的影響很小，說明紫草素用于治療卵巢癌是安全的。作為細胞的終末事件，壞死性凋亡是一種由多種信號分子有序調控的程序化死亡過程［13］。本研究結果發現，紫草素可顯著增加 PI+細胞和Annexin V+／PI+細胞的比例，而對于Annexin V+細胞的比例無明顯影響。進一步使用Hoechst 33342和PI染色定性分析顯示，紫草素處理的卵巢癌細胞并沒有表現出明顯的染色體凝聚、細胞核碎片化等細胞凋亡樣特征。說明紫草素誘導SKOV3和A2780細胞以劑量和時間依賴性的形式發生壞死性凋亡。

活性氧引起嚴重的DNA損傷和基因突變，及腫瘤細胞的活性炎癥，對于腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和血管生成具有促進作用；活性氧水平一旦達到閾值，腫瘤的生長將受到抑制，引起細胞結構分解和死亡［14］。后者也是大多數化療和放射治療殺死癌細胞的依賴機制。有研究顯示，活性氧往往是腫瘤細胞壞死性凋亡的“執行者”［15］，可引起細胞內源性分子包括蛋白質、脂質及核酸的損傷，從而促進壞死性凋亡進程［16］。本研究中使用DCFH-DA熒光探針檢測紫草素誘導卵巢癌細胞活性氧的產生，結果顯示，紫草素處理后可明顯誘發SKOV3和A2780細胞活性氧的產生。說明紫草素導致卵巢癌細胞發生的壞死性凋亡進程和活性氧的過量累積有關。

注：與對照組相比，**P ＜0.01；與紫草素組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜ 0.01。

對壞死性凋亡的機制研究發現，RIP1通過和RIP3結合而激活RIP3，形成RIP1／RIP3復合物，從而觸發了典型的壞死性凋亡過程［17］。因此，RIP1和RIP3是重要的壞死性凋亡相關蛋白。本研究中檢測RIP1和RIP3蛋白的表達活性顯示，紫草素處理后，卵巢癌細胞中RIP1和RIP3蛋白的表達顯著上調。另外，當預先使用NAC，Nec-1抑制劑預處理后，再使用紫草素誘導SKOV3和A2780細胞時，抑制劑預處理組SKOV3和A2780細胞的壞死性凋亡率明顯下降。進一步說明，紫草素抑制卵巢癌細胞的增殖和導致卵巢癌細胞發生壞死性凋亡相關，整個過程和活性氧的過量產生及激活RIP1和RIP3蛋白的表達密切相關。

綜上所述，紫草素可明顯抑制卵巢癌SKOV3和A2780細胞增殖，而對正常卵巢細胞毒性較低，其作用機制和誘導卵巢癌細胞產生大量的活性氧和上調RIP1和RIP3蛋白的表達，進而激活壞死性凋亡進程有關。