胃炎顆粒中3種活性成分的定性鑒別及芍藥苷含量測定*

胡 婧，胡 斌，鄧 莉，馬 攀

（陸軍軍醫大學西南醫院藥學部，重慶 400038）

胃炎顆粒系我院中醫科的經驗方，在古方芍藥甘草湯、黃芪建中湯的基礎上篩選優化而來［1-2］，是由蒲公英、黃芪、白芍、白芷、陳皮、建曲、甘草、佛手等8味中藥材組方的復方制劑，具有健脾益氣、舒肝和胃、止嘔降逆、清熱消炎的功效。主藥白芍的主要成分為芍藥苷，也是本品的有效指標成分之一［3］。為了有效地控制胃炎顆粒的質量，本研究中對胃炎顆粒進行了定性、定量研究，運用薄層色譜（TLC）法對3種主藥成分進行鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定指標性成分芍藥苷的含量，旨在為其質量控制和臨床應用提供參考，保障用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AS2060B型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號為 110736-201337，含量為94.9% ），黃芪甲苷對照品（批號為 110781-200512），白芷對照藥材（批號為120945-201309），均由中國食品藥品檢定研究院提供；胃炎顆粒（3批，自制，規格為每包10 g）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

黃芪：取樣品適量，研細，稱取10 g置具塞錐形瓶中，加甲醇 50 mL，在溫水（40 ～50 ℃）中超聲（60 kHz）處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加溫水（40～50℃）20 mL溶解，用水飽和的正丁醇萃取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗2次，每次30 mL，棄去氨試液，水洗2次，每次30 mL，棄去水液，將正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液［4］。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液［5］。按處方比例取缺黃芪的各藥材，加水煎煮，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，分別取上述溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上，日光下顯相同顏色斑點［6］，紫外光燈（365 nm）下顯相同顏色熒光斑點［7］302，陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

白芍：取樣品適量，研細，稱取10 g置具塞燒瓶中，加無水乙醇 50 mL，振搖，密塞，超聲（60 kHz）處理 10 min，靜置分層，濾過，收集濾液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL溶解，即得供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加無水乙醇制成每 1 mL含 1 mg的溶液，作為對照品溶液［7］105。按處方比例取缺白芍的各藥材，加水煎煮，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇 - 甲酸（20 ∶4 ∶0.05）為展開劑［8］，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 B。

白芷：取樣品適量，研細，稱取粉末5 g置燒杯中，加水30 mL溶解，超聲30 min，離心5 min，取上清液，溶液轉至分液漏斗中，用石油醚（60～90℃）30 mL萃取，靜置10 min，棄去石油醚層，剩余水層再用30 mL乙酸乙酯萃取，靜置10 min，取乙酸乙酯層水浴蒸干至1 mL。另取白芷對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。按處方比例取缺白芷的各藥材，加水煎煮，同法制成陰性樣品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述3種溶液各20 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板，以二氯甲烷-甲醇（20∶1）為展開劑，在20℃下展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定［9］

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent-TCC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（7 ∶13 ∶80）［10］；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL ／min；進樣量：10 μL；柱溫：30℃。理論板數以芍藥苷峰計大于3 000，且分離度大于1.5。

2.2.2 溶液制備

取芍藥苷對照品10.29 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，密塞，搖勻，制成質量濃度為0.195 3 g／L的芍藥苷對照品溶液，再精密移取3 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，密塞，搖勻，即得對照品溶液。取胃炎顆粒適量，研細，稱取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（60 kHz）處理 30 min，冷卻，擦干外部，稱定質量，用甲醇補足減失的質量［11］，搖勻，濾過，取濾液離心（13 000 r／min，5 min），取上清液，即得。按處方比例取缺白芍的各藥材，加水煎煮，依法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性考察：分別精密吸取2.2.2項下3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。在此色譜條件下，芍藥苷能較好地分離，且峰形良好，保留時間適中，陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關系考察：取芍藥苷對照品 26.62 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成質量濃度為1 010.49 μg ／mL 的芍藥苷對照品溶液，分別取 0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2 mL 稀釋至 10 mL，制成質量濃度為11.72，23.44，35.15，46.87，58.59，70.31 μg ／mL 的溶液，進樣10 μL，測定，記錄色譜圖，以進樣質量濃度（X，C）為橫坐標、峰面積（Y，A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=13.083X-1.268，r=0.999 9（n=6）。結果表明，芍藥苷進樣質量濃度在20～120 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取樣品（批號為17111302），精密稱定，依法制備供試品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.26%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為17111302），精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，6，12，24 h 時進樣，測定峰面積，結果的RSD為0.57%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為17111302）6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，進樣，記錄色譜圖。結果樣品中芍藥苷的平均含量為 1.066 9 mg／g，RSD為0.36%（n=6），表明方法重復性好。

加樣回收試驗：取樣品（批號 17111302，含量為1.066 7 mg ／g）0.5 g，精密稱定，共 6 份，分別加入芍藥苷對照品溶液［取芍藥苷對照品（批號為110736-201337，含量為 94.9% ）13.82 mg］，精密稱定，依法制備，用甲醇稀釋至50 mL，搖勻，精密吸取上述溶液各2 mL，分別加入上述6份樣品中，依法測定，計算回收率。結果見表1。由于中藥的成分復雜，雜質峰較多，且樣品顏色較深，加樣回收范圍從98%～102%擴大至 95% ～105% ，RSD小于 2.0% （n=6），準確度符合要求。

表1 芍藥苷加樣回收試驗結果（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取樣品（批號分別為 17070101，171009，17111302）各3份，依法制備供試品溶液，進樣，測定峰面積。結果，3個批次9個樣品中每10 g芍藥苷的含量平均值為14.62 mg。考慮到中藥材原料含量的波動，以平均值下浮 20% 作為本品含量的下限［9］，即 14.62 mg ／10 g ×80%=11.69 mg ／10 g，故暫訂本品每袋（10 g）含芍藥苷（C23H28O11）總量不得少于 11 mg。

3 討論

胃炎顆粒成分復雜［12-13］，白芍為主藥，芍藥苷為白芍中含量較高且較穩定的成分［14-15］，故將其作為指標性成分進行含量控制，采用HPLC法測定其含量。在前期的研究中，采用50%的乙醇對胃炎顆粒進行提取，流動相采用的是乙腈 - 水（19 ∶81）［16］。本研究預試驗中，發現在此條件下的色譜圖出現了明顯的雜質峰干擾，且目標峰芍藥苷的峰面積較小，重復性差。根據芍藥苷的理化性質，特別是溶解性，采用甲醇和乙醇作為提取溶劑進行比較，結果甲醇的提取率明顯高于乙醇。樣品處理時，采用不同比例含水量甲醇（20%，50%，80%，100%）進行提取，發現100%甲醇的提取效率最高，且雜質也最少。在流動相的選擇上，在原有研究［17］及2015年版《中國藥典（一部）》白芍藥材的含量測定方法［7］105的基礎上進行進一步優化，鑒于芍藥苷在酸性環境下較為穩定，將原流動相中的水改為0.1%磷酸溶液，將乙腈改為乙腈-甲醇（7∶13）的混合溶劑，結果芍藥苷峰形對稱，基線平穩，有很好的分離效果，方法學驗證結果符合2015年版《中國藥典》的相關規定，且減少了乙腈等有機溶劑的用量，減少對人的危害和對環境的污染，可用于胃炎顆粒中芍藥苷的含量測定。

根據3批樣品含量測定結果，考慮到本品含量隨原料產地及部位的不同含量有一定波動，并考慮大生產實際，將本品的限度下浮20%，則每袋含芍藥苷為11.69 mg。2015年版《中國藥典（一部）》白芍藥材項下規定飲片中芍藥苷含量不得少于1.6%，而每袋本制劑理論含2.667 g白芍。按此限度及正文擬訂的藥材限度計算，本 品 轉 移 率 為 27.4% ［11.69 mg ／袋 ÷ （16 mg／g×2.667 g／袋）×100%=27.4% ］。故本品含量限度設定是合理可行的。故暫訂本品每袋（10 g）含芍藥苷（C23H28O11）總量不得少于 11 mg。

胃炎顆粒藥味多，陰性干擾大，本試驗中通過對提取溶劑和展開劑的優化篩選，對方中黃芪、白芍、白芷進行了薄層色譜鑒別。白芷薄層色譜鑒別中，先采用藥典的方法及常規制劑，選取的提取方式和展開溶劑，陰性有干擾，分離度較差。考慮到白芷主要化學成分為香豆素和揮發油，揮發油類通常采用水蒸氣蒸餾法進行提取，香豆素類則主要采取溶劑提取法［10］，因此，考察的成分基本為香豆素類。乙醚雖可溶解多數香豆素，但能溶出其他脂溶性成分也較多，即按藥典方法進行提取后的斑點干擾較多；而石油醚雖對大多數含氧香豆素的溶解性并不好，但可除去其他脂溶性成分，利于減少陰性干擾［18］；選擇石油醚（60 ～ 90 ℃ ）先進行萃取，再用乙酸乙酯提取剩余水層，取乙酸乙酯層。在采用藥典規定展開劑石油醚（60～90℃）-乙醚進行展開時，由于乙醚易揮發，特征斑點重復性較差，選擇極性略低于乙醚的二氯甲烷作為基礎展開劑［19］，分別采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇等溶劑進行配伍，發現以二氯甲烷-甲醇為展開劑，分離效果較理想；先后采用了二氯甲烷-甲醇（10 ∶1，15 ∶1，20 ∶1）等比例調節。根據薄層色譜法所規定的方法學要求，最終確定展開劑為二氯甲烷-甲醇（20 ∶1）。

綜上所述，胃炎顆粒雖在臨床應用多年，但現行質量標準制定已久，考察項目較少，標準不夠完整，更無有效或指標成分的含量控制，本研究中建立了較為完善的質量標準，可滿足日常生產中的質量控制，從而保證制劑質量的穩定性和有效性。