木香順氣丸毛細管電泳指紋圖譜研究

王玲嬌 ，孫國祥，鄭玉玲，楊繼章，于 靜△

（1.河北醫科大學第一醫院，河北 石家莊 050031； 2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016）

木香順氣丸由木香、砂仁、香附（醋制）、檳榔、甘草、陳皮、厚樸（制）、枳殼（炒）、蒼術（炒）和青皮（炒）等10味中藥組方的中藥復方，傳統劑型為水丸［1］，具有行氣導滯、燥濕健脾等功效，常用于治療食積、腹痛、氣郁等癥［2］。藥典中收載的質量標準為用高效液相色譜（HPLC）法測定厚樸酚含量，現有應用HPLC法建立的特征指紋圖譜［3］和甲醇提取物的指紋圖譜［4］，測定橙皮苷、厚樸酚、厚樸酚、木香烴內酯等制劑中單個或多個成分的含量［5-8］。文獻 ［9-11］采用薄層色譜法定性鑒別木香順氣丸質量。毛細管電泳技術具有高效、快速、經濟且易于清洗等優點［12-15］，目前已廣泛應用于中藥復方制劑的成分分析。本研究中針對不同電解質對色譜條件進行考察，建立了木香順氣丸的毛細管電泳指紋圖譜（CEFP），并采用系統指紋定量法對其質量等級進行評價，為木香順氣丸的全面質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HPCE-10S型高效毛細管電泳儀（大連江申分離技術科學公司）和自制重力進樣裝置，數據由江申色譜數據工作站記錄；未涂層石英毛細管（河北永年光導纖維廠）；KQ-120D型超聲波清洗器（寧波科生儀器廠）；Sartorius BS 110S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司）；RE-52型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；PHS-3DC型精密數顯酸度計（滬新科學儀器廠）；微孔濾膜（0.45 μm，上海興亞凈化材料廠）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，山東禹王實業有限公司）；橙皮苷對照品（hesperidin，HI，721-8601，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）；硼砂、碳酸鈉均為分析純；所用水為去離子水；16批木香順氣丸（水丸）的批號及來源見表1。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取橙皮苷對照品適量，精密稱定，用運行緩沖溶液溶解，即得對照品溶液。取木香順氣丸約6 g，精密稱定，加入50 mL 75%乙醇回流提取1.5 h，過濾，殘渣加入50 mL 75%乙醇繼續回流1 h，過濾，殘渣再加入40 mL 95%乙醇再回流1h。合并3次濾液，減壓濃縮至約10mL，然后用95%乙醇定容至25 mL，搖勻，作為供試品溶液，進樣時用背景電解質（BGE）稀釋1倍。

表1 16批木香順氣丸（水丸）的廠家和批號

2.2 毛細管電泳條件

色譜柱：石英毛細管柱（65 cm×75 μm，有效長度60 cm）；紫外檢測波長：228 nm；靈敏度：0.005 AUFS；運行電壓：11.0 kV；電流：110 mA；BGE：30 mmol／L 硼砂，100 mmol／L 碳酸鈉（含 8% 乙腈）；重力進樣：20 s；高度：8.5 cm。每次試驗開始前用BGE沖洗毛細管柱5 min，再運行3 min后進樣，試驗結束后每天依次用0.1 mol／L NaOH 和水沖洗毛細管 10 min。為了提高電泳遷移時間的重復性，每進樣5次后更新緩沖液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取橙皮苷對照品溶液和木香順氣丸供試品溶液適量，分別進樣，記錄電泳圖，對比遷移時間可知5號峰為（遷移時間約為24.4 min）橙皮苷。在供試品溶液中加入橙皮苷對照品溶液，進樣分析，結果電泳峰增益圖也顯示此峰為橙皮苷，色譜圖見圖1。因橙皮苷峰與相鄰組分分離較好，且遷移時間適中，因此選作參照物峰。

精密度試驗：取S1號供試品溶液，連續進樣5次，以5號峰（橙皮苷峰）為參照，計算共有峰相對遷移時間的RSD均小于4.0%（n=5），相對峰面積的RSD均小于4.0%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取S1號樣品制備供試品溶液，分別于0，3，6，9，12 h 時進樣測定，計算各共有峰相對遷移時間的RSD均小于3.0%（n=5），相對峰面積的RSD均小于4.0%（n=5），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

圖1 毛細管電泳圖

重復性試驗：取S1號樣品制備供試液5份，進樣檢測，結果共有峰相對遷移時間的RSD均小于4.0%（n=5），相對峰面積的RSD均小于 4.0% （n=5），表明方法重復性良好。

2.4 木香順氣丸CEFP的建立

共有指紋峰的標定：按擬訂電泳條件對16批供試品溶液在毛細管電泳儀上進樣分析，記錄電泳圖，以各峰與參照物峰（橙皮苷峰）的相對遷移時間和相對峰面積標定其指紋特征，按峰出現率100%計，確定了14個共有指紋峰。參照物峰標號為5（S），其他共有峰依次為1，2，3，……，14。

木香順氣丸對照指紋圖譜（RFP）的建立：將16批木香順氣丸毛細管電泳指紋圖譜原始信號導入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0軟件，按平均值法計算生成準對照指紋圖譜，計算16批樣品的宏定性、宏定量相似度值，以此值為變量建立木香順氣丸對照指紋圖譜。

木香順氣丸高效毛細管電泳（HPCE）統一化指紋圖譜：參考中藥統一化色譜指紋圖譜的創建方法［16］和統一化色譜指紋圖譜相對統一化理論［17-18］，并發展了用25個數字化判據參數描述統一化色譜指紋圖譜的相對統一化特征，可解決同一樣品在不同檢測儀器上得到的指紋圖譜的比較評價問題。采用中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0軟件生成16批樣品指紋圖譜（S1-S16）及對照指紋圖譜的統一化圖譜，詳見圖2。對統一化指紋圖譜進行評價，獲得相對統一化判據參數，詳見表 2。結果顯示：1）指紋峰時間分布（rt_avg）在 0.6左右，說明指紋峰分布集中在圖譜中部；ra_avg均小于0.5，說明多數指紋峰積分較小。2）峰等距性參數（α，α′，π），因 α＞0.5表明各指紋圖譜峰等距性較好；峰后等距系數（α′）＜0.4，說明虛擬圖譜峰等距性較差；前后等距系數比（π）以S7最大，其次是S3和S13較大，反映上述樣品的指紋峰達到后等距較難。3）色譜指紋圖譜定點指數（Fα／t）是rti=1時rai的擴展程度，其值越小越好，S5，S8，S10較小，表明其指紋圖譜容易達到該理想狀況。V=4.0～15.0，v=0.3～1，g=1.6～2.6，結果顯示，不同批次藥品色譜峰分布不是很均勻。4）色譜指紋圖譜信號指數（Ft／a）從總體上反映各指紋峰rai=1時rti擴展程度的大小，其值越小越好，以S5最小，說明圖譜達到理想狀況最容易。b_avg=3.8～13，B=44.4～181.9，b_avg′=6.2 ～17.5，均表明各樣品峰多數峰明顯小于大峰，達到最大峰面積時較困難；擴展率（f）≥5.7，表明各成分含量分布差異較大；擴展比（p）=2.7～10.4，表明各峰積分信號均較大；兩種指數比值（ξ）＞5.24，表明統一化指紋圖譜較差。5）積分效率指數（E，ē，q）表明S15出峰最快，信號最大且積分速率最高；峰體大小指數（Λt，Λ）均較大，反映化合物成分較難被洗脫。6）色譜空間利用率（φ，%）代表色譜指紋圖譜的空間利用效率，φ均小于0.45%，表明統一化指紋圖譜的空間利用率很低。相對時間斜率因子（K）均較小，說明反應峰分散程度較小。其相關系數（r）代表了指紋出峰時間的均勻性，r越大，出峰越均勻。r＞0.9，說明色譜峰的分布均勻性一般。

圖2 16批木香順氣丸統一化毛細管電脈指紋圖譜

表2 木香順氣丸統一化特征判據參數

表3 系統指紋定量法評價木香順氣丸質量級別

2.5 系統定量法評價木香順氣丸質量

以對照指紋圖譜為評價標準，采用系統指紋定量法［19-20］評價計算16批木香順氣丸的質量，判定其質量級別，結果見表2。若規定Sm≥0.75時樣品化學成分數量和分布比例合格，結果僅S6，S10，S14不合格，其余各個批次均合格。若含量相似度（Pm）合格標準為60%≤Pm≤140% （α≤0.40），發現 S2，S9，S10，S12，S13，S14質量均因含量太高或太低而引起質量下降，其余批次產品均合格。

2.6 用聚類分析法評價木香順氣丸質量等級

以16批木香順氣丸建立對照指紋圖譜得到的Sm和Pm為指標導入SPSS 13.0統計軟件進行聚類分析。由圖3可見，16批木香順氣丸的質量等級由于其宏定性、宏定量參數的2個不同方向出現了兩大聚類，即S1，S3，S5，S7，S8，S10，S12，S14，S13 為一類，而 S2，S4，S6，S9，S11，S15，S16 為另一大類，2 個聚類的結果也表明質量等級的兩端化差異決定了需要用16批木香順氣丸平均生成對照指紋圖譜，以減少由于使用某一聚類生成對照指紋圖譜造成的誤差。

3 討論

3.1 樣品溶劑選擇

供試品溶液濃度與BGE的離子強度有差異可能會對分離有影響，因此考察了供試品溶液直接進樣和用BGE稀釋1倍進樣，結果發現供試品溶液濃度大時容易堵柱，證明離子強度的差異對不同濃度的供試品溶液有影響，故采取用BGE稀釋1倍的方法進樣。

3.2 BGE選擇

本研究中曾考察不同電解質及不同pH的磷酸鹽、硼酸、硼酸鹽和硼酸鹽-磷酸鹽組成的BGE對電泳條件的影響，結果分離效果均不理想。查閱文獻［21-23］，針對電解質一（30 mmol／L Na2B4O7，100 mmol／L Na2C2O3和 8% 乙腈），電解質二（15 mmol／L Na2B4O7，80 mmol／L硼 酸 和 50 mmol／L SDS），電 解 質 三 （30 mmol／L Na2B4O7，10 mmol／L Na2HPO4和 20% 乙腈 ），對電泳條件進行了選擇。根據電泳譜圖情況，選擇電解質一，進一步考慮添加不同比例有機改性劑和調節pH進行再優化。

圖3 16批木香順氣丸宏定性相似度聚類譜系

3.3 添加劑對分離的影響

在電解質一中加入不同濃度的甲醇、乙腈時，甲醇的加入使組分分離度增大，但峰展寬嚴重，且出現過多的峰拖尾現象，而當用乙腈時分離明顯改善，加入不同比例的乙腈，最終試驗確定用12%的乙腈；加入表面活性劑SDS、庚烷磺酸鈉時使得基線噪音增大；當加入三乙胺后（可降低緩沖液黏度）色譜峰分離沒有什么改善。用磷酸調節電解質一的pH，分離狀態也未出現明顯變化。對電解質一進行進一步優化，通過添加不同比例的乙腈和三乙胺、SDS及調節不同pH，比較各個電泳圖譜，結果發現在 30 mmol／L Na2B4O7，100 mmol／L Na2C2O3和12%乙腈時電泳圖譜最好，色譜峰基本分離。

3.4 分離電壓影響

考察了電壓 9，10，11，13，18 kV 的效果，發現電壓低時基線穩定，但分析時間長，隨著電壓的增加，分析時間縮短，而且峰形變窄，分離度增大，但基線漂移嚴重，綜合考慮最終選擇了11 kV。