金銀花及其制劑中摻偽山銀花的快速鑒別研究

王立偉，徐 達，安麗娜，申玉龍，金艷敏，宋長國

（承德燕峰藥業(yè)有限責任公司，河北 承德 067600）

山銀花和金銀花系忍冬科植物，收載于2015年版《中國藥典（一部）》［1］，其中規(guī)定金銀花來源于忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，山銀花來源于灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.，紅腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.，華南忍冬Loniceraconfuse DC.或黃褐毛忍冬 Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花。但兩者在2000年版《中國藥典》前為同一品種［2］，之后藥典又將山銀花從金銀花中分列出來，作為單列品種［3］。兩者性狀特征較相似，但金銀花價格要高出山銀花很多，故在金銀花及其投料制劑中摻偽山銀花的情況屢見不鮮［4］。曾有報道，以山銀花的特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙可鑒別山銀花和金銀花［5-7］。又有報道，綠原酸、木犀草苷和灰氈毛忍冬皂苷乙是金銀花和山銀花的共有成分，只有川續(xù)斷皂苷乙才是山銀花的專屬成分［8］。但因其含量遠較灰氈毛忍冬皂苷乙低，特別是摻偽的情況下，再折算提取率，導致取樣量太大，方法無應用價值。還有人對金銀花和山銀花從不同方面進行了對比分析［9-12］。為能簡便快捷地識別在金銀花及其制劑中摻偽的山銀花，本研究中用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLCELSD）對灰氈毛忍冬皂苷乙的特征斑點進行定量確認，可快速、準確鑒別金銀花及其制劑中摻偽山銀花，摻偽量在2%以上即可準確判斷。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司，包括LC-20AT型四元泵，SIL-20型自動進樣器，CTO-10AS vp型柱溫箱，LCsolution型色譜工作站）；ZAM 4000X型蒸發(fā)光散射檢測器（德國珊貝克公司）；數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

清開靈顆粒（K廠家，批號為170509），清開靈片（L 廠家，批號為 1703004；M 廠家，批號為 170308），雙黃連顆粒（N廠家，批號為150675），復方金銀花顆粒（O 廠家，批號為 7271607；P廠家，批號為 17051111）；山銀花（灰氈毛忍冬）對照藥材（批號為 121595-201202），金銀花對照藥材（批號為 121060-200805，121060-201107，121060-201608），灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（批號為111814-201604），川續(xù)斷皂苷乙對照品（批號為111813-201403），均購自中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）。金銀花（批號分別為160615，1600626，170509，20170621），山銀花（批號為20170051），均購自石家莊市不同藥店，由河北省藥品檢驗研究院段吉平主任藥師鑒定前者為忍冬Lonicerajaponica Thunb.，后者為灰氈毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand.。乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 金銀花和山銀花點樣量確認

取金銀花對照藥材和山銀花（灰氈毛忍冬）對照藥材各0.1 g，分別加甲醇 2 mL，超聲處理15 min，取上清液作為各自的供試品溶液。另取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg溶液，作為對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液2 μL和5 μL，山銀花供試品溶液 1，2，3，4，5 μL，金銀花供試品溶液 2，4，6，8，10，12，15 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -濃氨試液（0.5 ∶0.5 ∶10 ∶1）為展開劑，展開，取出，熱風吹干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，暗室內(nèi)，通過燈光檢視。山銀花供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上，點樣量在0.05～0.012 5 mg山銀花藥材均呈現(xiàn)相同顏色斑點，斑點分離良好，無拖尾；金銀花點樣量在0.1～0.75 mg內(nèi)主斑點分離良好，無拖尾（見圖1），但0.75 mg的點樣量時主斑點足夠大，已是點樣的最大量。結(jié)果表明，山銀花藥材點樣量在0.05 mg，灰氈毛忍冬皂苷乙的斑點已較明顯，按測定的山銀花對照藥材灰氈毛忍冬皂苷乙含量7.73%計算，其含灰氈毛忍冬皂苷乙為0.003 9 mg。金銀花最大點樣量是山銀花最低檢出量的15倍。

圖1 對照藥材點樣量確認的薄層色譜圖

2.2 金銀花與摻偽金銀花的薄層色譜鑒別

2.2.1 薄層色譜鑒別

取摻偽2%，5%，10%，20%山銀花對照藥材（灰氈毛忍冬皂苷乙含量為7.73%）的金銀花樣品5份，分別加甲醇2 mL，超聲處理15 min，取上清液，作為供試品溶液。吸取上述5種溶液及2.1項下對照藥材溶液與對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -濃氨試液（0.5∶0.5∶10∶1）為展開劑，展開，取出，熱風吹干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，暗室內(nèi)，通過燈光檢視。供試品溶液色譜中，山銀花和摻偽金銀花在與對照品溶液色譜相應位置上均顯相同顏色斑點，而金銀花在與對照品溶液色譜相應位置上無相同顏色斑點。結(jié)果表明，在金銀花中山銀花摻偽量達2%即可檢出灰氈毛忍冬皂苷乙的斑點（見圖2）。

圖2 摻偽金銀花的薄層色譜圖

2.2.2 HPLC-ELSD 定量確認

色譜條件：采用2015年版《中國藥典（一部）》山銀花灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的定量方法，對摻偽2%，5%，15%的樣品進行HPLC-ELSD定量測定。色譜柱為 Agilent 5 TC-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.4% 醋酸溶液（B），梯度洗脫（見表 1）；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速為 1.0 mL／min；柱溫為 30 ℃；進樣量為 5 μL，10 μL，20 μL。

表1 流動相梯度洗脫表

溶液制備：取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品、川續(xù)斷皂苷乙對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含灰氈毛忍冬皂苷乙0.6 mg、川續(xù)斷皂苷乙0.2 mg，作為對照品混合溶液。分別取山銀花對照藥材，摻偽2%，5%，15%的金銀花粉末（過4號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

測定方法：分別精密吸取對照品溶液5，20 μL，供試品溶液5～20 μL，注入液相色譜儀，以外標兩點法對數(shù)方程計算灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的含量。3個代表性摻偽樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的含量測定結(jié)果見表2和圖3，其含量數(shù)據(jù)基本與添加的理論值一致。由表2可見，在金銀花中摻偽的山銀花，其理論上含灰氈毛忍冬皂苷乙的含量與實測值基本一致。

表2 金銀花對照藥材中摻偽山銀花對照藥材的含量測定結(jié)果（%）

2.3 金銀花市售藥材及對照藥材中山銀花的鑒別

圖3 金銀花對照藥材中摻偽山銀花對照藥材測定的高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器色譜圖

取4批市售金銀花藥材，粉碎，各取 0.1 g，分別加甲醇2 mL，超聲處理15 min，取上清液，作為各自的供試品溶液。吸取上述供試品溶液，2.1項下的對照品溶液、對照藥材溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（0.5 ∶0.5 ∶10 ∶1）為展開劑，展開，取出，熱風吹干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，暗室內(nèi)，通過燈光檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點的，即判為摻偽金銀花。結(jié)果表明，4批市售金銀花中，3號斑點未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙；1號斑點隱約出現(xiàn)，摻偽在2%以下；2號斑點和5號斑點呈現(xiàn)較清晰，結(jié)合2.2項下的薄層色譜圖分析，摻偽山銀花量在5%以上（見圖4）。3批不同年份生產(chǎn)的金銀花對照藥材在最大點樣量 15 μL（0.75 mg）時，均未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙（見圖5），即金銀花在薄層鑒別探討的點樣范圍內(nèi)檢測不到灰氈毛忍冬皂苷乙。

圖4 4批市售金銀花中山銀花薄層色譜圖

圖5 3批金銀花對照藥材中山銀花薄層色譜圖

2.4 金銀花制劑中山銀花的檢測

含金銀花的復方制劑因組方不同，方中所含金銀花的量相差懸殊。檢測時，既要考慮金銀花的取樣量，還要考慮薄層展開時其他斑點的拖尾情況，所以一般點樣量相當于金銀花藥材的0.27～0.36 mg（相當于山銀花點樣量0.05 mg的5～7倍）。在該劑量下，是不應檢出灰氈毛忍冬皂苷乙斑點的；若檢出，即認為制劑中摻偽了山銀花。按上述原則，依法檢測6批制劑樣品，結(jié)果見圖 6 和表 3。可見，4，5，7，8，9 號斑點未檢出山銀花的灰氈毛忍冬皂苷乙，只有山銀花和點樣6號斑點檢出了灰氈毛皂苷乙，即說明6號斑點摻偽了山銀花。

圖6 市售金銀花制劑中山銀花的薄層色譜圖

2.5 金銀花及其制劑中摻偽山銀花樣品的定量確認

為進一步判斷薄層鑒別法的準確性，分別對山銀花（灰氈毛忍冬）對照藥材、圖5中的3批金銀花對照藥材和圖4中的市售金銀花對照藥材（批號為20170601）、圖6中的6批金銀花制劑，采用2.3項下的灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的測定方法，進行了HPLCELSD定量檢測，結(jié)果見表4和圖7。由表4可見，結(jié)合金銀花對照藥材中摻偽山銀花對照藥材的含量數(shù)據(jù)分析，市售金銀花4號的摻偽量為15%；清開靈片（批號為170308），按處方中金銀花藥材含量計，其摻偽量約在10%～15%。因摻偽山銀花的含量高低影響制劑中摻偽百分數(shù)的判斷，故實際檢測中很難控制其準確含量。建議在正常點樣量范圍內(nèi)，金銀花藥材或其制劑中不應檢出灰氈毛忍冬皂苷乙斑點。

只有圖7 B（山銀花對照藥材）、圖7 D（市售金銀花藥材）和圖7 G（清開靈片）在與灰氈毛忍冬皂苷乙與川續(xù)斷皂苷乙對照品相同的保留時間，呈現(xiàn)相同的色譜峰，即檢出了該二皂苷，且與薄層鑒別結(jié)果一致。

圖7 11批樣品中山銀花含量的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器色譜圖

金銀花及其制劑中摻偽山銀花的快速鑒別。取市售金銀花藥材0.3 g，山銀花（灰氈毛忍冬）對照藥材0.1 g，分別加甲醇2 mL，超聲處理15 min，取上清液，作為市售金銀花和山銀花對照藥材的供試品溶液。另取灰氈毛忍冬皂苷乙適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。再取含金銀花的復方制劑適量，加甲醇制成每1 mL相當含金銀花0.07 g的供試品溶液。吸取上述市售金銀花藥材溶液5 μL、山銀花對照藥材1～2 μL、對照品溶液 2 μL、含金銀花制劑 5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（0.5 ∶0.5 ∶10 ∶1）為展開劑，展開，取出，熱風吹干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，暗室內(nèi)，通過燈光檢視。市售金銀花藥材溶液與金銀花復方制劑溶液的色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應位置上不應出現(xiàn)相同顏色的斑點，如出現(xiàn)則可判斷在金銀花藥材及其制劑中摻偽了山銀花。

3 討論

于中國食品藥品檢定研究院購買的不同年份的3批金銀花對照藥材的薄層色譜和HPLC-ELSD中均未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙，與文獻［5-6］報道一致。2015年版《中國藥典（一部）》中金銀花只有1種，即忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花；而山銀花有4種，即灰氈毛忍冬 Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.、紅 腺 忍 冬Lonicera hypoglaucaMiq.、華南忍冬Lonicera confusaDC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花，但市場上的主流品種是灰氈毛忍冬，偶有紅腺忍冬，華南忍冬和黃褐毛忍冬較難見到。本研究中，華南忍冬和黃褐毛忍冬未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，但因難以收集到樣品（各自僅1個批號），故無法做出結(jié)論［13］。考慮到其流通量極少，市場上也就無法進行摻偽，即灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙就成了區(qū)別金銀花與山銀花的特征點。

表4 11批樣品檢測結(jié)果

由圖3可知，在金銀花中山銀花摻偽量在2%即可檢出灰氈毛忍冬皂苷乙斑點。由圖5和圖6可知，市售金銀花（批號為20170621）和清開靈片（批號為170308）摻偽了山銀花，其摻偽量按山銀花對照藥材的含量（灰氈毛忍冬皂苷乙7.73%和川續(xù)斷皂苷乙1.02%）計算，市售金銀花（批號為20170621）的摻偽量為15%，清開靈片（批號為170308，按處方中的金銀花藥材含量計）摻偽量在10%～15%。因摻偽山銀花的含量高低影響制劑中摻偽百分數(shù)的判斷，故實際檢測中很難控制其準確含量。金銀花藥材或其制劑在正常點樣量范圍內(nèi)（即點樣量相當0.27～0.36 mg金銀花藥材）是不應檢出明顯的灰氈毛忍冬皂苷乙斑點的，如檢出即可判斷摻偽了山銀花。

山銀花與金銀花的薄層主斑點是不同的。由圖1可知，山銀花對照藥材的主斑點是灰氈毛忍冬皂苷乙，含量高，而其他斑點較小；由圖4可知，金銀花對照藥材中不含灰氈毛忍冬皂苷乙，無此斑點呈現(xiàn)，但其主斑點在Rf值0.45處，遠較其他斑點含量高。隨著摻偽山銀花量的增加，金銀花的主斑點減小，灰氈毛忍冬皂苷乙的斑點增大，但具體金銀花主斑點是何種成分有待進一步研究。

綜上所述，本鑒別方法簡便、快捷，供試品溶液和對照藥材溶液均用簡單的甲醇超聲，上清液點樣，即可。甲醇提取可排除含蔗糖制劑的蔗糖干擾，獲得了清晰的薄層色譜圖，可準確檢測金銀花及其制劑中的摻偽山銀花。