人參皂苷Rh2免疫調節作用研究進展

黃容容 錢 穎 向 明

(華中科技大學同濟醫學院藥學院生物藥學系，武漢 430030)

人參皂苷Rh2是一種四環三萜類皂苷單體，按結構分類屬于二醇型人參皂苷(Protopanaxadiol，PPD)，是人參中的稀有皂苷[1]。Rh2最早發現于紅參中，后來亦在西洋參、三七等多種中藥中分離得到[2]，目前Rh2的獲取方法有提取分離法、酸處理轉化法和生物轉化法[3,4]，這些技術為Rh2的工業生產奠定了基礎。藥理學研究表明Rh2對免疫系統、中樞神經系統、內分泌系統、心血管系統等均有調節作用，具有抗腫瘤、抗過敏、抗抑郁、抗衰老及改善心肌缺血等功效[5,6]。由于免疫系統在許多人類疾病的發生發展及轉歸中扮演重要角色，因此Rh2的免疫調節活性研究及其在防治免疫性疾病中的應用價值引起人們的關注。在抗腫瘤方面，Rh2不但可以通過促進腫瘤細胞凋亡、阻滯腫瘤細胞周期等機制抑制多種腫瘤的發展[7,8]，還可以增強機體抗腫瘤免疫應答、改善化療藥的免疫抑制作用[9]。Rh2還有顯著的抗炎作用，可以抑制細菌內毒素(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的炎癥反應，并對阿爾茲海默癥、過敏性哮喘、過敏性皮炎等具有潛在治療作用[10,11]。本文就Rh2在免疫調節方面的作用作如下綜述。

1 Rh2對腫瘤免疫的調節作用

目前Rh2腫瘤免疫調節作用的研究主要集中于對腫瘤微環境中免疫細胞功能及細胞因子分泌的影響，表現為促進T淋巴細胞增殖，誘導腫瘤周圍M2型巨噬細胞向M1型分化，增強NK細胞、CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性，調節腫瘤微環境中的細胞因子分泌等。

1.1Rh2增強腫瘤環境中效應性T細胞活性 免疫反應是機體對抗腫瘤的基本途徑，效應性T淋巴細胞是免疫反應中具有抗腫瘤作用的最主要的效應細胞之一，分為CD4+輔助性T細胞和CD8+細胞毒性T細胞。CD4+輔助性T細胞通過促進B細胞活化、激活NK細胞等殺傷腫瘤細胞，CD8+細胞毒性T細胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)通過分泌能介導腫瘤細胞溶解或凋亡的穿孔素/顆粒酶、TNF-α、IFN-γ等直接或間接發揮抗腫瘤作用[12，13]。

研究發現Rh2可以促進黑色素瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T淋巴細胞浸潤，增加腫瘤周圍T細胞數量；同時該研究的非放射性細胞毒性實驗發現與模型組小鼠相比，Rh2處理組小鼠T細胞具有較高的殺傷活性，提示Rh2提高腫瘤周圍T細胞數量的同時還能增強T細胞活性[14]。Rh2及其主要代謝產物R-PHQ和S-PHQ上調環磷酰胺誘導的免疫功能低下小鼠的免疫應答：Rh2阻止荷瘤小鼠免疫器官萎縮，促進ConA刺激的脾細胞增殖，恢復CD4+/CD8+T比例，并抑制CD4+CD25+T細胞水平[15]。臨床研究表明Rg3可以上調鼻咽癌放療患者的CD4+T/CD8+T細胞比例，Rh2是Rg3體內降解的主要活性產物，這提示Rh2也可能增加鼻咽癌患者的CD4+T、CD8+T細胞[16]。另外，Rh2的硫酸化修飾產物Rh2-B1激活CD8+T細胞株CTLL-2中p38MAPK和ERK依賴的信號通路并抑制p56 Lck和STAT5蛋白表達，從而促進CTL-2細胞增殖和IFN-γ的分泌，增強抗腫瘤免疫應答[17]。

1.2Rh2調節腫瘤相關巨噬細胞表型及活性 巨噬細胞是非特異性免疫防御的重要成員，具有吞噬、遞呈抗原，調控局部組織微環境等多種功能，按作用及所處環境不同可分為M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞、腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macroph-ages，TAMs)等[18，19]。TAMs存在于腫瘤組織中，在腫瘤微環境下TAMs向M2型極化促進腫瘤的發展與轉移，M1型巨噬細胞可通過分泌活性氧和氮中間體來殺死腫瘤細胞，同時分泌TNF-α和IL-1β招募CTL來攻擊腫瘤細胞[20]，研究表明逆轉腫瘤組織TAMs向M1極化，有助于抑制腫瘤生長[21]。

Li等[22]報道，Rh2通過調節TAMs與非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)之間的相互作用阻止腫瘤遷移和侵襲，用Rh2處理TAMs與NSCLC共培養的細胞系A549、H129，發現Rh2減少M2型巨噬細胞標記物CD206分子和血管內皮生長因子VEGF，增加M1型巨噬細胞標記物CD16/32分子，同時減少NSCLC中基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)MMP2和MMP9。除了Rh2外，另有研究報道參芪扶正注射液也有促進TAMs向M1型極化的作用[23]。Rh2還可以增強環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的巨噬細胞吞噬能力，H22荷瘤小鼠巨噬細胞吞噬能力和碳清除率測試結果顯示，與環磷酰胺組比較，Rh2及其代謝物R-PHQ和S-PHQ預處理組增強腹膜巨噬細胞的吞噬功能和碳清除指數[15]。

1.3Rh2增強腫瘤周圍NK細胞毒性 NK細胞是一種非特異性免疫細胞，其抗腫瘤方式包括直接殺傷腫瘤細胞和介導T細胞殺傷腫瘤：一方面，NK細胞識別靶細胞后釋放顆粒酶B和穿孔素，穿孔素在腫瘤細胞膜上形成“孔道”使水、電解質和顆粒酶B進入腫瘤細胞，從而直接誘導腫瘤細胞凋亡；另一方面，激活的NK細胞促進DC成熟，誘導Th1細胞極化并提高細胞毒性T細胞的殺傷活性，從而介導特異性抗腫瘤免疫[24，25]。文獻報道人參總皂苷能提高肝臟腫瘤組織中浸潤NK1.1+細胞數量，上調NK細胞穿孔素、顆粒酶B釋放，從而增強對腫瘤的殺傷作用[26]。H22荷瘤小鼠的NK細胞活性處于嚴重低下狀態，而人參皂苷Rh2干預處理明顯增強NK細胞殺傷活性[27]。從健康女性的外周血中分離出NK細胞，用二醇型人參皂苷PPD處理，發現NK細胞群(NKG2A)的受體NKp30、NKp46增加，IFN-γ產生增加，IL-10表達降低[28]。

1.4Rh2調節腫瘤微環境中細胞因子分泌 腫瘤微環境中的細胞因子極為復雜，按功能不同分為兩大類：一類是促炎癥細胞因子，包括IL-2、IL-7、IL-12、IFN-γ、TNF-α等；另一類是抑炎癥因子，包括IL-10、IL-13和TGF-β等[29]。促炎癥細胞因子由T細胞、M1型巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞產生，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α在抑制腫瘤生長過程中起著重要作用：IFN-γ主要由活化T細胞產生，能激活巨噬細胞，誘導TNF-α的表達從而殺傷腫瘤細胞[30]；TNF-α由巨噬細胞、腫瘤浸潤的CD8+T細胞和NK細胞產生，促進腫瘤凋亡[31]。抑炎癥因子由Treg、M2型巨噬細胞、髓系抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)等免疫抑制細胞和腫瘤細胞產生，具有抑制免疫和促進腫瘤生長的作用：例如IL-10、IL-6、TGF-β抑制DC成熟，抑制效應性T細胞及NK細胞活化，同時誘導MDSCs增殖，造成腫瘤細胞免疫逃逸[32]。

有研究報道Rh2有效抑制人白血病細胞HL-60和多種腫瘤細胞如K562、A549和MCF7的生長增殖，微陣列分析發現Rh2明顯上調HL-60的TNF-α表達，抗TNF-α抗體減弱了Rh2誘導的細胞凋亡，提示Rh2通過TNF-α信號傳導途徑誘導細胞凋亡[33]。Wang等[34]報道Rh2上調結腸癌小鼠血清中IL-6、IL-18、TNF-α的分泌水平，緩解腫瘤相關的免疫抑制現象，延長結腸癌小鼠的生存期。Han等[35]報道20(S)-Rh2通過抑制JAK2/STAT3通路和MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達而抑制結腸癌細胞侵襲，IL-6刺激HCT116細胞顯著增加JAK2的酪氨酸磷酸化，20(S)-Rh2處理則抑制這種磷酸化，表明Rh2能抑制炎癥環境下的腫瘤生長[35]。

2 Rh2治療炎癥相關免疫性疾病

炎癥是機體自身的防御反應，適度炎癥有利于機體抵御感染、異物入侵、清除損傷組織等，但過度炎癥則會導致組織損傷和多種疾病的發生，即造成炎癥相關免疫性疾病，例如變態反應、阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease，AD)等，異常嚴重時甚至導致器官衰竭。研究發現Rh2具有抗炎作用，對AD、變態反應等炎癥相關免疫性疾病有治療作用。

2.1Rh2抑制細菌內毒素誘導炎癥反應 巨噬細胞既是機體重要的固有免疫細胞，又是介導炎癥反應的主要細胞之一。LPS通過巨噬細胞表面TLR4受體激活細胞進而促進炎癥介質釋放，引起巨噬細胞中iNOS、COX-2的高表達和NF-κB信號通路的活化，炎癥蛋白和PGE2過量產生，促炎癥細胞因子NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等大量分泌[36，37]，進一步激活其他免疫細胞并釋放相應的細胞因子，這些免疫細胞及炎性因子過度堆積造成組織炎癥及免疫疾病的發生。而抑炎因子IL-10和TGF-β能夠抑制炎癥細胞因子的產生，降低LPS造成的炎癥反應和組織損傷。

據報道富含人參皂苷Rh2的人參根部水提物可以抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞釋放活性氧(ROS)[38]，推測Rh2對細菌內毒素引起的炎癥反應具有抑制作用。而另外幾項研究報道證實了上述的推測，其中Bi等[39]報道增加水溶性基團修飾后的Rh2-B2顯著抑制RAW264.7巨噬細胞TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放，同時增加IL-10的產生，其作用機制是Rh2-B2顯著抑制p38 MAPK和c-Jun N末端激酶的磷酸化以及NF-κB入核，通過阻斷絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB信號通路抑制由LPS誘導的巨噬細胞炎癥[40]。除此之外，Rh2能夠抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞中PGE2、ROS和原基質金屬蛋白酶-9(pro-MMP-9)的產生，以及抑制人HaCat角化細胞ROS水平和MMP-9、MMP-2活性，抑制角質形成細胞中TNF-α誘導的MMP-9明膠酶活性[41]。由于LPS誘導的炎癥反應參與感染性或部分自身免疫性疾病(例如炎癥性腸病)的病理進程，因此Rh2的抗炎功效提示其可能在防治該類疾病上具有一定的作用。

2.2Rh2對AD的治療作用 AD是一種中樞神經系統退行性疾病，特征性病理改變為細胞外β淀粉樣蛋白沉積、細胞內Tau蛋白過度磷酸化形成神經纖維纏結以及小神經膠質細胞活化造成神經元損傷[42]。Aβ纖維能夠誘發神經小膠質細胞介導的慢性炎癥反應，激活的神經小膠質細胞釋放毒性產物，包括前炎性因子、氧自由基、蛋白激酶、化學趨化因子和興奮性毒素等，損傷周圍神經元，從而引起神經元凋亡，突觸丟失，進而發生神經退行性改變[43，44]。AD患者腦內老年斑周圍大量活化的小神經膠質細胞和星形膠質細胞中核轉錄因子NF-κB增高，引起多種炎性相關基因的轉錄，促使炎癥細胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β和NO等產生[45]；同時，環氧合酶COX1/2也參與了小神經細胞活化和PGs合成，對神經細胞造成炎性損傷[46]。總之，AD成因眾多，免疫系統進行性衰竭和慢性炎癥是重要的誘因及病理變化。

Qiu等[47]通過原代神經細胞和Tg2576轉基因小鼠體內實驗證明Rh2能調節淀粉樣前體蛋白APP內吞作用，減少腦內Aβ積聚，改善Tg2576轉基因小鼠的學習和記憶功能。Kumar等[48]報道Rh2可抑制LPS引起的炎癥反應及小膠質細胞神經毒性，顯著增加小膠質細胞中TGF-β的表達，降低NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和iNOS的生成，有效地抑制小膠質細胞的活化和促炎細胞因子的產生，改善神經變性。Hou等[49]報道Rh2能顯著降低三甲基錫(Trimethyltin，TMT)誘導的小鼠癲癇發作頻率，同時Rh2處理能減少TMT誘導的星形膠質細胞死亡及炎癥細胞因子IL-1α/β、IL-6、TNF-α、MCP-1的活化，保護少突膠質細胞并減少氧化應激和神經炎癥，其作用機制是選擇性上調PI3K/AKT通路和抑制ERK活化。

2.3Rh2對變態反應性疾病的治療作用 變態反應是機體受到抗原刺激引起組織損傷或功能紊亂的病理性免疫反應，常發生于呼吸道、皮膚、消化道等部位，引發哮喘、過敏性皮炎、過敏性鼻炎、濕疹等疾病。過敏性哮喘是一種慢性炎癥疾病，發病機制是過敏原與它們的互補免疫球蛋白IgE結合，激活IgE受體肥大細胞和嗜堿性粒細胞，致使Th1/Th2型細胞失衡，Th2細胞分化增加，炎癥細胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等產生增多[50，51]，進一步導致肺內嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞浸潤[52]，在該過程中NF-κB參與Th2細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞及巨噬細胞的炎癥反應[53，54]。過敏性皮炎是由過敏源引起的皮膚炎癥，發病過程與過敏性哮喘類似，該過程有NF-κB/STAT6信號通路的參與[55，56]。

在過敏性哮喘小鼠模型中，Rh2減輕氣道炎癥反應，降低總卵清蛋白特異性IgE水平以及肺組織和肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13蛋白水平，增加IFN-γ蛋白水平，其分子機制是阻止小鼠肺組織IκB-α的磷酸化降解和NF-κBp65易位入核，抑制MAPKp38磷酸化，從而抑制炎癥，緩解哮喘[57，58]。有報道Rh2抑制過敏性炎癥：在小鼠接觸性皮炎模型中，Rh2有效抑制耳腫脹，降低小鼠耳朵組織中COX-2、IL-1β、IL-4、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達水平，表現出抗炎和治療過敏性皮炎的活性[59]。此外，Rh2可治療LPS誘導的動物急性肺損傷，通過阻斷iNOS、COX-2、IκB-α、ERK、JNK、p38MAPK、Raf-1和MEK蛋白的磷酸化，降低促炎介質NO、TNF-α、IL-1β的產生，發揮抗炎作用[60]。人參皂苷Rg3也可治療小鼠急性肺損傷，顯著抑制小鼠體內促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，同時防止抗炎細胞因子IL-10和TGF-β的減少，降低肺部炎癥[61]。

3 總結與展望

目前研究表明人參皂苷Rh2具有調節腫瘤免疫及治療炎癥相關免疫性疾病的活性或潛能。值得注意的是，Rh2在不同疾病背景中對免疫系統的調節作用不盡相同：在腫瘤微環境導致的免疫抑制情況下，Rh2提高CD4+T、CD8+T細胞比例，通過p38 MAPK通路激活CTL細胞并使其INF-γ產生量增加，Rh2作用于VEGF分子促進M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化，產生TNF-α、INF-γ、IL-6等正向免疫因子，提高機體免疫應答；然而在炎癥、AD、變態反應等免疫亢進情況下，Rh2通過COX1/2、NF-κB、p38 MAPK/JNK 和PI3K/AKT等信號通路抑制NO、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平，同時增加抗炎因子IL-10和TGF-β的產生，抑制機體免疫亢進。關于Rh2在腫瘤免疫和炎癥相關免疫性疾病中對免疫細胞及細胞因子調節情況不同的疑問，根據現有資料推測這可能與不同疾病背景下Rh2對不同免疫細胞群具有選擇性調節作用有關，具體原因有待探討。

Rh2的免疫調節功能雖然得到了大量體內外實驗數據的支持，但是其作用靶點及具體機制仍未得到完全闡釋：一方面Rh2調節腫瘤免疫的分子機制(如調節巨噬細胞極化)有待進一步深入研究；另一方面Rh2具有的抗炎作用，提示其可能對感染性、慢性炎癥性疾病(如2型糖尿病)及急性肺損傷等炎癥相關免疫性疾病有防治作用，療效尚需驗證。此外，目前Rh2增強腫瘤免疫的藥效學研究主要處于動物實驗階段，臨床研究有待加強，以拓展其臨床轉化應用。