miRNA調(diào)控Wnt/β-catenin通路與糖尿病骨質(zhì)疏松的中西醫(yī)研究進展?

陳 哲，李惠林，李增英，趙恒俠，周熠楠，帥優(yōu)優(yōu)

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033； 2. 深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033)

糖尿病骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis，DOP)是指糖尿病并發(fā)的以骨質(zhì)疏松為主要表現(xiàn)的一種代謝性骨病，屬于糖尿病并發(fā)癥中發(fā)病率較高的一種疾病。糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制復(fù)雜，糖尿病可通過多種途徑影響骨代謝，但有關(guān)糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病的分子機制仍有待明確。Wnt/β- catenin通路是成骨細(xì)胞分化和骨基質(zhì)形成的關(guān)鍵途徑，在促進成骨細(xì)胞分化過程中起著重要作用[1]。而成骨細(xì)胞形成、數(shù)量及其分化能力在糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程中也密切相關(guān)，且miRNA可以調(diào)控Wnt信號通路關(guān)鍵因子的表達，對Wnt信號通路具有強大的調(diào)控作用[2]。現(xiàn)對miRNA調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路與糖尿病骨質(zhì)疏松關(guān)系的中西醫(yī)研究進展綜述如下。

1 miRNA與Wnt/β-catenin信號通路

miRNA是一類廣泛存在于真核生物染色體上的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，主要通過與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)域特異性不完全堿基互補配對，降解靶mRNA或抑制其負(fù)性表達而發(fā)揮生物學(xué)作用[3]。由于miRNA可以結(jié)合多個靶標(biāo)，有人提出它們可以調(diào)節(jié)基因組中高達30%的蛋白質(zhì)編碼基因，是重要的基因表達調(diào)控因子[4]。miRNA已成為當(dāng)今世界的研究熱點之一。而miRNA在調(diào)控Wnt信號通路中起關(guān)鍵作用，是Wnt信號通路調(diào)控的基礎(chǔ)。

Wnt /β-catenin通路又稱為經(jīng)典的Wnt信號通路。在此信號通路中，Wnt蛋白通過與細(xì)胞跨膜特異性受體卷曲蛋白(frizzled，F(xiàn)rz) 及輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6 (LDL-receptor-relatedprotein5/6，LRP5/6) 結(jié)合，活化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)散亂蛋白(dishevelled，Dsh)，抑制β-catenin與軸蛋白(Axin)、結(jié)直腸腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)等形成降解復(fù)合物，使GSK-3β的底物β-catenin 免受降解而在胞內(nèi)積聚，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控細(xì)胞增殖和分化[5]。Wnt /β-catenin 信號通路受GSK-3β、APC、Dsh、DKKs、Sclerostin、SFRPs等因子調(diào)控。其中DKKs是由2個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域組成的發(fā)育調(diào)控信號分子，其能夠通過直接與LRP5/6結(jié)合抑制Wnt 蛋白與LRP5/6的結(jié)合，從而使Wnt 信號通路受到抑制[6]。骨硬化蛋白(Sclerostin)則是由硬化蛋白基因SOST編碼、由骨細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白，其抑制Wnt /β-catenin信號通路的作用也是通過與Wnt蛋白競爭結(jié)合LRP5/6受體[7]。而分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRPs)則包含一個與Frizzled 蛋白結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域，可直接與Wnt 配體相結(jié)合，從而作為Wnt 信號通路的內(nèi)源性拮抗劑抑制Wnt 信號通路[8]。

2 Wnt/β-catenin信號通路在骨重建過程中的調(diào)控作用

Wnt/β-catenin信號通路可直接影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的分化過程，在膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨過程中，若β-catenin基因失活則間充質(zhì)干細(xì)胞不是向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，而是分化為軟骨細(xì)胞[9]。Kobayashi等發(fā)現(xiàn)，在β-catenin基因敲除小鼠的膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨的過程中，BMSCs向軟骨細(xì)胞分化而非分化為成骨細(xì)胞[10]。體外敲除β-catenin基因的鼠顱蓋骨細(xì)胞也進一步證實，Wnt通路會影響成骨細(xì)胞分化和骨形成。Mbalaviele G等研究即發(fā)現(xiàn)，缺失β-catenin基因的顱蓋骨細(xì)胞在成骨培養(yǎng)下轉(zhuǎn)向軟骨細(xì)胞分化，而野生型的鼠顱蓋骨細(xì)胞則向成熟的成骨細(xì)胞分化[11]。

Wnt/β-catenin通路除了具有可以促進成骨細(xì)胞分化的作用外，也可抑制破骨細(xì)胞分化。由成骨細(xì)胞表達的核受體KB激活受體配體(receptor activator of NF-KB ligand，RANKL)，與破骨細(xì)胞表面的受體RANK結(jié)合后，可促進破骨細(xì)胞的分化增殖，而同樣由成骨細(xì)胞表達的骨保護素(osteprotegerin，OPG)，作為RANKL的假性受體，二者之間具有高度的親和力，可以阻礙RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞分化增殖，減少骨量丟失[12]。有研究指出，成骨細(xì)胞中β-catenin的失活將導(dǎo)致RANKL/OPG比值增加，使骨質(zhì)減少，而APC的缺失則會使比值減小，骨量增加，故Wnt/β-catenin通路可通過下調(diào)RANKL、上調(diào)OPG使比值增大，間接調(diào)控骨吸收[13]。

3 miRNA調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路在成骨分化中的作用

miRNA對Wnt/β-catenin通路具有強大的調(diào)控作用，可以調(diào)控該通路中多種關(guān)鍵因子的表達，在成骨分化過程中具有重要作用。Kapinas等研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路可以誘導(dǎo)miR-29a的表達，高表達的miR-29a可直接抑制該信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子DKK1、Kremen2、SFRP2，促進成骨分化信號的傳遞[14]。miR-218也是促進成骨細(xì)胞分化Wnt通路的強大的激活者。Hassan等研究發(fā)現(xiàn)，miR-218可通過下調(diào)Wnt信號通路的3種抑制劑Sclerostin、DKK2、SFRP2激活Wnt通路[15]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，miR-335-5p可通過下調(diào)DKK1增強Wnt通路信號，從而促進GSK-3β磷酸化和β-catenin 轉(zhuǎn)錄表達，調(diào)節(jié)成骨分化[16]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，miR-27的表達水平與Wnt信號通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的β-catenin呈正相關(guān)，且驗證了miR-27直接靶向抑制APC基因表達，使β-catenin積累從而激活Wnt信號傳導(dǎo)，促進成骨細(xì)胞分化[17]。Guo等研究發(fā)現(xiàn)，SFRPs是miR-27a的靶標(biāo)，在間充質(zhì)前體細(xì)胞系(hFOB1.19)分化中，miR-27a可通過抑制SFRPs的表達，激活Wnt信號通路，從而促進成骨細(xì)胞增殖和分化[18]。Su等研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a通過抑制靶基因GSK-3β實現(xiàn)對Wnt信號通路的調(diào)控，miR-26a 的過表達可以增加BMSCs中β-catenin表達，增強Wnt信號通路，促進BMSCs向成骨分化[19]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，SOST是miR-204的靶基因，miR-204的表達增加可以抑制SOST水平，這表明miR-204可以通過抑制SOST的表達激活Wnt信號通路，促進成骨分化[20]。

但也有研究顯示，miRNA可對成骨分化進行負(fù)性調(diào)控。如miR-23a的過表達抑制體外hBMSCs的成骨分化，而miR-23a的下調(diào)則促進成骨分化，進一步研究證實LRP5是miR-23a的直接靶標(biāo)，敲低LRP5抑制hBMSCs的成骨分化，與上調(diào)miR-23a中觀察到的效果相似，表明miR-23a在hBMSCs的成骨分化中起抑制作用，其可能通過靶向LRP5而起作用[21]。Liang等通過檢測miR-141和miR-22在成骨過程中的表達譜，發(fā)現(xiàn)二者均顯著下調(diào)，通過用miRNA模擬轉(zhuǎn)染hMSC，結(jié)果顯示miR-141和miR-22均顯著下調(diào)共同靶標(biāo)β-Catenin的表達水平，而用miR-141和miR-22抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞則顯示，抑制劑對miR-141和miR-22的抑制作用使β-Catenin的表達水平上調(diào)。進一步研究證實，miR-141和miR-22顯著減少成骨細(xì)胞分化過程中鈣結(jié)節(jié)的形成，而且通過RT-PCR檢測各種成骨相關(guān)標(biāo)志物基因，顯示miR-141和miR-22下調(diào)大部分成骨標(biāo)志物基因，表明這2種miRNAs是成骨細(xì)胞分化的潛在負(fù)調(diào)節(jié)因子[22]。

4 Wnt/β-catenin信號通路與糖尿病骨質(zhì)疏松的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究

在糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程中，Wnt/β-catenin信號通路異常已被得到證實。Portal-Nunez等通過測定STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的骨密度及β-catenin蛋白表達量，證實糖尿病大鼠存在顯著的骨量下降，骨形態(tài)發(fā)生改變，其成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞中的β-catenin表達量也顯著下降。將β-catenin下降程度與骨細(xì)胞減少程度進行對比，結(jié)果表明β-catenin的下降并非是骨細(xì)胞活性降低引起。此外該研究也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的β-catenin數(shù)量顯著減少，并伴隨WIF-1、Wisp1和Wnt1等蛋白表達量的顯著下降，證實糖尿病大鼠存在Wnt/β-catenin通路的失調(diào)，此通路失調(diào)與糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病有重要聯(lián)系[23]。Hie等研究則發(fā)現(xiàn)，由STZ誘導(dǎo)的胰島素依耐性糖尿病大鼠在胰島素缺乏時SOST和Dkk1表達增加，導(dǎo)致Wnt通路被抑制，成骨分化減弱[24]。López-Herradón等通過研究STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠，發(fā)現(xiàn)暴露于高糖下的MC3T3-E1細(xì)胞其LRP5和LRP6表達下降，但DKK1的表達顯著增強，而DDK1可以抑制與Wnt3a刺激有關(guān)的TCF/LEF依賴性轉(zhuǎn)錄活性和β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的累積，證明與糖尿病相關(guān)的骨質(zhì)減少癥存在Wnt/β-catenin通路的下調(diào)[25]。Yee等研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠Sclerostin水平升高，β-catenin活性降低，與Sclerostin作為Wnt拮抗劑的功能一致，而SOST抗體(SostAb)的治療則增強了β-catenin活性，促進成骨細(xì)胞分化和骨化礦化，在STZ誘導(dǎo)的T1DM骨折模型中挽救了受損的成骨[26]。

國內(nèi)也有相關(guān)研究，如Jin等研究發(fā)現(xiàn)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，其成骨細(xì)胞分化及抗凋亡能力明顯受損[27]。Qian等通過研究高脂飲食/低劑量鏈脲霉素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠，發(fā)現(xiàn)BMSCs的細(xì)胞代謝活性、堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化和成骨基因表達均降低，反映Wnt信號的表達水平基因，如β-catenin、細(xì)胞周期蛋白D1和c-myc也顯著降低，但GSK-3β的表達保持不變，2型糖尿病大鼠BMSCs的成骨潛能不受培養(yǎng)環(huán)境影響，但會因為Wnt信號通路的抑制而受損。這可能是由于β-catenin的積累不足而不是因為GSK-3β的刺激[28]。王燕研究也發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠和去卵巢大鼠LRP5及β-catenin表達均明顯減低，表明2型糖尿病去卵巢大鼠骨組織Wnt信號通路抑制是2型糖尿病和去卵巢共同作用的結(jié)果，而2型糖尿病去卵巢大鼠和去卵巢大鼠骨組織LRP5及β-catenin表達減少，同時Runx2表達明顯減低，提示W(wǎng)nt信號通路抑制可能下調(diào)基因影響成骨細(xì)胞分化和骨形成[29]。

5 基于Wnt/β-catenin信號通路防治骨質(zhì)疏松的中醫(yī)藥研究

近年來，基于Wnt 信號通路運用中醫(yī)藥防治疾病的研究逐漸增多，已成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。而基于Wnt/β-catenin信號通路防治骨質(zhì)疏松的中醫(yī)藥研究，也已取得了不少成果。陳云剛等用不同濃度骨碎補含藥血清干預(yù)BMSCs，發(fā)現(xiàn)骨碎補含藥血清能夠促進BMSCs增殖，提高ALP活性，促進鈣化結(jié)節(jié)的形成，其機制與骨碎補含藥血清上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、LRP5、Runx-2及Osteriex的表達及下調(diào)GSK-3β的表達密切相關(guān)[30]。涂艷等通過體外培養(yǎng)SD大鼠的BMSC，并給予淫羊藿苷干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)ALP的活性增強，Wnt10b、GSK-3β、β-catenin、Runx2及LEF1表達水平上調(diào)，初步證明淫羊藿苷可以激活Wnt/β-catenin信號通路，參與并調(diào)控BMSC的成骨分化[31]。張哲等通過觀察Wnt/β-catenin信號通路在老鸛草素誘導(dǎo)小鼠BMSCs增殖和成骨分化中的作用，發(fā)現(xiàn)老鸛草素各劑量組Wnt3a、β-catenin、Axin2、Runx2和蛋白表達較對照組顯著上調(diào)，GSK-3β和蛋白表達較對照組顯著下調(diào)且呈劑量依賴性，證明老鸛草素能夠明顯促進BMSCs的增殖及向成骨方向分化，其機制與Wnt/β-catenin信號通路的激活有關(guān)[32]。許應(yīng)星等研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血顆粒含藥血清能夠顯著上調(diào)β-catenin、LRP5和TCF的蛋白表達，增強成骨細(xì)胞的成骨活性和礦化能力，表明其治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)[33]。何幫劍等通過觀察益骨湯含藥血清對SD大鼠成骨細(xì)胞的經(jīng)典Wnt信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)益骨湯可以抑制DKK1的高表達，從而上調(diào)Wnt/β-catenin通路中β-catenin、LRP-5、TCF的表達，達到促進成骨細(xì)胞增殖而起到抗骨質(zhì)疏松作用[34]。而李玲慧等觀察溫腎陽、滋腎陰中藥復(fù)方對大鼠成骨細(xì)胞影響的差異以及相關(guān)的分子生物學(xué)機制，發(fā)現(xiàn)右歸丸可顯著上調(diào)β-catenin表達，下調(diào)GSK-3β蛋白表達，且較左歸丸更為顯著，表明溫腎陽復(fù)方右歸丸可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，提高成骨細(xì)胞分泌ALP的能力[35]。

6 基于Wnt/β-catenin信號通路防治糖尿病骨質(zhì)疏松的中醫(yī)藥研究

隨著基于Wnt通路防治骨質(zhì)疏松的中醫(yī)藥研究的不斷深入，中醫(yī)藥通過該通路防治糖尿病骨質(zhì)疏松的研究也開始涌現(xiàn)。李翠娟等通過觀察固本活血壯骨顆粒對糖尿病大鼠模型成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的影響，發(fā)現(xiàn)固本活血壯骨顆粒可提高糖尿病模型成骨細(xì)胞Wnt1、LRP-5以及β-catenin蛋白的表達，從而調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的失調(diào)狀態(tài)，促進骨形成，減少骨吸收，起到防治糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的作用[36]。許建國通過觀察糖尿病性骨質(zhì)疏松模型大鼠骨代謝相關(guān)血生化指標(biāo)、骨密度及骨組織中Wnt及NF-κB信號通路中相關(guān)因子表達的變化以及補腎健脾活血湯的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)補腎健脾活血湯可以提高DOP大鼠骨組織中Runx2、LRP5、β-catenin表達水平，降低TRAF6、NF-κB、NFATc1表達水平，表明補腎健脾活血湯可通過激活Wnt信號通路，抑制NF-κB通路相關(guān)因子表達，進而起到抗糖尿病性骨質(zhì)疏松的作用[37]。本課題通過研究滋腎降糖丸對糖尿病大鼠Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)糖尿病通過下調(diào)Wnt3α、LRP-5、β-catenin及Runx-2基因的表達，導(dǎo)致大鼠骨組織Wnt/β-catenin通路障礙，從而影響成骨細(xì)胞分化，而滋腎降糖丸能上調(diào)Wnt/β-catenin通路中上述重要基因的表達，促進成骨細(xì)胞分化，發(fā)揮防治糖尿病骨質(zhì)疏松的作用[38]。

7 展望

糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制復(fù)雜，影響因素較多，miRNA調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中的作用機制尚未完全明確。中醫(yī)藥資源豐富，其多途徑、多靶點的作用特點在防治疾病中具有較大優(yōu)勢和挖掘潛力。目前基于Wnt/β-catenin信號通路探討中醫(yī)藥防治糖尿病骨質(zhì)疏松的研究也日益增多，但中醫(yī)藥通過調(diào)控相關(guān)miRNA表達，進而介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路以防治糖尿病骨質(zhì)疏松的作用機制仍需進一步研究。本課題組目前正對miRNA通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)糖尿病骨質(zhì)疏松的作用機制及中醫(yī)藥的干預(yù)作用進行相關(guān)研究，相信隨著研究的深入，miRNA調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制必將得到揭示，并通過研究中醫(yī)藥對此信號通路的干預(yù)作用，為今后探討中醫(yī)藥防治糖尿病骨質(zhì)疏松的作用機制提供新的思路和方法。