代謝組學在藥物性肝損傷研究中的應用

徐 榛， 鄧中平， 孫嘉彬

（上海中醫藥大學藥物安全評價研究中心，上海 201203）

肝臟作為機體物質代謝的最主要器官，也是藥物損傷的主要靶點，藥物性肝損傷是指藥物在使用過程中因藥物本身或其代謝產物所導致的肝臟損傷，輕者停藥后即可恢復，嚴重者可造成不可逆的肝損傷甚至死亡，隨著新藥的廣泛應用和人們對傳統中藥的不斷重視，該疾病越來越受到重視。Suk等[1］發現，每10萬人中有13.9～24人患有藥物性肝損傷；Bj?rnsson等[2］報道，每10萬個普通居民中即有19.1人患病，為冰島發病率最高的疾病之一。另外，個體差異同樣對藥物性肝損傷的預測和診斷造成很大影響，以老年人及女性更敏感，肝病史、肥胖、吸煙、飲酒也均可提高患病風險[3-5］。

傳統的肝臟損傷研究主要采用體內與體外評價體系，在敏感性和特異性方面存在明顯不足。代謝組學技術作為系統生物學的重要組成部分，在藥物毒性或安全性評價等方面表現出巨大的應用潛力，它主要以生命活動的下游小分子代謝產物 （MW＜1 000）為研究對象，以特異敏感、高通量檢測方法為基礎，主要包括核磁共振 （NMR）、氣相色譜-質譜 （GC-MS）、液相色譜-質譜 （LC-MS） 技術，常用于研究藥物代謝規律、尋找差異代謝物、考察作用靶點及機制等方面[6］。因此，本文對近年來代謝組學在藥物性肝損傷標志物篩選、肝損傷機制及損傷修復等方面的應用進展進行綜述。

1 藥物性肝損傷診斷標志物篩選

藥物性肝損傷癥狀可能類似于各種肝臟疾病，目前對其診斷尚無靈敏、特異的方法。國際上主要以RUCAM法，即通過Hy｀s法則及危險因素計分表排除法進行判斷，其中前者以血清中谷丙轉氨酶和堿性磷酸酶升高作為診斷標準，但敏感性較差，而藥物性肝損傷病情復雜預后性差，待確診時往往肝損傷已經較為嚴重難以恢復，甚至導致死亡，故尋找準確敏感的生物標志物為大家所關注。

隨著對藥物性肝損傷研究的不斷深入，發現因果關系及 Hy｀s 法則有很大的局限性和不準確性[7］。 Teschke 等[8］回顧文獻發現，分別有14%、11%的案例由于替代原因及診斷未成立而未能納入藥物性肝損傷范疇。RUCAM法雖然準確性較高，但診斷較繁瑣，標準界定模糊，難以推廣，至2017年我國僅有13.4%的文獻采用該方法，同時其實際應用中診斷標準多、主觀性強也影響了病情治療和恢復[9］。目前，關于藥物性肝損傷的診斷仍有較多困惑：①關于藥物性肝損傷仍缺乏特異生物標志物，給確診帶來極大困難，近年來人們在尋找新型標志物上取得了很多成果，如谷氨酸脫氫酶、miRNA-122、結合型膽汁酸等，但仍處于研究階段，其普遍適用性等問題尚未得到臨床確證[10-11］；②藥物性肝損傷患者可能同時服用多種成分復雜的藥物，導致病因難以確認，故在臨床中涉及常見易致藥物性肝損傷藥物 （如抗結核病藥物、抗生素等）時應同時聯合護肝藥物以更密切關注肝臟情況[12-13］；③由于個體差異，導致易致藥物性肝損傷藥物在不同患者使用后反應差異大，并且在病情出現之前鑒別出哪些患者易感的難度非常大，故在診治老年人、有肝病史等易感人群時要更密切關注肝臟情況，盡量避免使用可能有損傷的藥物。徐曾麗[14］等對藥物性肝損傷患者臨床分型與病理學檢查進行對應研究，發現兩者并沒有明顯相關性，故應將精力集中于發展因果關系和利用各種技術與組學，尋找新型生物標志物來代替現有指標[15］。

通過代謝組學技術對肝損傷不同階段和類型的差異代謝物進行分析，從而尋找可能的早期生物標志物和代謝異常，可為藥物性肝損傷診斷提供新視角[16-17］。Mattes等[18］取苯妥英、氟他胺、丙硫氧嘧啶、拉米夫定、甲氨蝶呤、卡托普利、奈法唑酮、奈韋拉平、丙戊酸9種已知潛在有肝臟毒性的藥物，以及齊多夫定、阿托品、甘露醇、新霉素、鏈霉素和萬古霉素6種無肝臟毒性的藥物對大鼠血清進行代謝組學分析，發現代謝物分析方法可對大鼠潛在藥物性肝損傷進行信號探測；盛云華等[19］對黃藥子肝臟毒性研究時發現，給予大鼠5 g／kg乙醇提取物后血清脂質、谷氨酸、磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿等6種早期潛在生物標志物較傳統生物標志物 [谷丙轉氨酶 （ALT）、谷草轉氨酶（AST）］可在尚未出現肝臟病理變化時即出現異常，同時何首烏以40 g／kg劑量給藥大鼠1周后，血清PCA分析即出現分離，油酰胺、溶血性磷脂膽堿、白三烯、雙氫皮層醇等代謝產物出現明顯變化，較傳統指標更為敏感[20］，此外臨床藥物性肝損傷患者代謝譜較正常人也出現明顯變化；安卓玲、李小芬等[21-22］分別通過比較藥物性肝損傷患者與健康受試者代謝圖譜建議，應著重關注溶血卵磷脂、膽汁酸、氨基酸類等成分的變化；Kim等[23］在對臨床上對乙酰氨基酚肝臟毒性進行研究時發現，人體內代謝組學技術較傳統血清生化檢測可更敏感地指征肝臟損傷，受到不同藥物導致的肝損傷機制復雜、個體差異及環境因素影響，不同實驗報道的生物標志物缺乏一致性和可重復性，難以直接應用到臨床。目前，通過研究新的軟件及建立穩定可靠的標志物篩選模型成為研究熱點，Xia等[24］引用ROCCET工具協助進行ROC曲線分析，對發現的差異代謝物進行篩選；Chen等[25］通過對不同分類模型進行對比分析，優選隨機森林法可用于建立生物標志物模型，提示代謝組學技術可輔助臨床藥物性肝損傷診斷和研究，具有良好的應用前景，同時，如何整合和建立準確可靠的差異代謝組，使其更好更快應用于臨床也將成為關注的熱點。

膽汁酸代謝作為肝臟代謝中的重要途徑，可反映肝損傷程度，有利于提高診斷靈敏性。藥物性肝損傷發生時，可在血液、尿液、肝臟中檢測到膽汁酸代謝異常，而且在低劑量和早期即有明顯變化，成為病情潛在生物標志物和機制的熱點[26-27］。例如，給予90、180 mg／kg利福平可使小鼠膽固醇7α-羥化酶基因的表達增加，并抑制膽鹽輸出泵表達，從而造成膽汁淤積型肝損傷，以180 mg／kg劑量更明顯，具有量效關系[28］；通過對膽汁酸代謝網絡進行分析發現，64 mg／kg黃毒素B可使牛磺酸結合型膽汁酸迅速提高，較傳統指標能更好地表征黃藥子所致肝臟毒性[29］；給予小鼠臨床劑量非諾貝特后，可通過上調Cyp7a1來加速膽固醇代謝調節血糖和血脂，同時可導致去氧膽酸的急劇升高，從而引起肝臟損傷[30］；課題組前期對山豆根造成肝臟毒性機制探索中發現，給藥可使膽酸、去氧膽酸等升高，并降低牛磺酸結合型膽酸含有量。

目前，在臨床前肝臟生物標志物研究中主要通過制造肝毒性動物模型，然后對其差異代謝物進行分析，主要通過差異代謝物及代謝通路異常的途徑，與其他研究方法相互印證的方法尋找肝臟的特異標志物。通過代謝組學技術探索生物標志物不僅可彌補現有診斷方法不足，還能預測其發生風險，對藥物性肝損傷進行病情評估等具有重要意義。但代謝組學技術篩選特異性生物標志物的過程繁瑣復雜，尤其在代謝通路分析及標志物驗證過程中對現有代謝物數據庫要求高，由于代謝物受環境、個體差異等因素的影響較多，故難以找到穩定可靠的共有生物標志物，目前發現的藥物性肝損傷生物標志物尚處在實驗研究階段。因此，建立與藥物性肝損傷密切相關的通用標準數據庫將是今后代謝組學技術研究相關生物標志物的重要內容之一。

2 藥物性肝損傷損傷機制研究

根據Hy｀s法則，目前藥物性肝損傷主要分為肝細胞型、膽汁淤積型、混合型，其損傷機制復雜多樣，為診斷和治療帶來困難。代謝組學技術可通過對代謝物變化的分析探究肝損傷作用機制和靶點，為考察其肝損傷機制和影響的代謝通路提供新的方向。

阿霉素通過影響苯丙氨酸等代謝產物的合成和代謝，擾亂氨基酸、脂質、嘌呤代謝、能量代謝、生物轉化等代謝過程，從而造成肝損傷[31］；他莫昔芬造成肝細胞氧化應激，導致糖代謝和能量代謝異常，使脂肪酸重新在肝內轉換淤積而造成肝損傷；氟他胺通過使細胞氧化應激，導致體內產生過量膽紅素而造成黃疸[32］；氯丙嗪使線粒體、內質網功能降低，肝臟抗氧化應激受損，繼而導致糖酵解和三羧酸循環的改變等造成膽汁淤積，75 mg／kg劑量較37.5、53 mg／kg劑量可使代謝成分明顯分開，其結果與病理及蛋白質組學結論一致，為闡明該藥物肝毒性機制提供線索[33］。

馬致潔[34］通過對何首烏患者血清進行代謝分析，尋找到40個差異代謝物，其機制主要是由于氧化應激及影響膽汁酸的分泌而造成的肝損傷和膽汁淤積，同時用大鼠血清和L-02細胞進行了驗證，為解釋該藥材造成肝毒性的機制和類型提供動物和分子水平的依據。通過給予大鼠臨床等效及20倍劑量雷公藤，可引起肝內免疫介導肝毒性及脂質過氧化損失，導致6-磷酸葡萄糖胺、溶血磷脂、色氨酸、胍基乙酸、3-吲哚丙酸、可的松和泛醌等代謝物異常，造成氨基酸代謝等途徑發生紊亂[35］。蒼耳子可引起小鼠肝臟嚴重脂質過氧化，其損傷機制主要與其影響肝細胞能量代謝有關[36］。給予小鼠1.35、0.15 g／kg雄黃后，其血清和尿液代謝PCA譜均有明顯區分，并具有劑量效應關系，差異代謝物顯示毒性機制主要與其干擾能量代謝和氨基酸代謝相關，結果與生化檢測分析一致[37］。重樓皂苷作為臨床抗癌和抗炎的有效藥物，其副作用和肝臟毒性也被報道，然而傳統指標對其并未有靈敏的指示。Man等[38-39］基于GC-MS對其代謝譜分析研究，發現在350 mg／kg劑量下重樓皂苷可降低線粒體氧化還原能力及CYP1A2、CYP2E1、UGTs mRNA水平，從而抑制糖酵解、脂肪酸氧化及三羧酸循環，同時導致肝脂肪變性的產生。首次驗證了其肝臟毒性并對其機制進行了探索。

目前，藥物性肝損傷損傷機制主要有①通過影響肝細胞進而造成代謝通路紊亂及代謝物異常；②通過影響肝內代謝通路造成代謝異常，進而造成肝臟損傷；③通過導致肝細胞或肝功能損傷而致使代謝物失調，代謝物淤積進一步造成肝臟損傷幾種途徑，兩者往往相互影響，從而加重對肝臟的損傷。代謝組學技術可為探索藥物性肝損傷的機制提供了新的思路和方向，它以內源性小分子為目標化合物來研究藥物致肝損傷作用特點和規律，與基因組學和蛋白質組學相比更能描述藥物引起的毒性機制及毒性與時間的相關性，并能為藥物的安全性評價提供數據參考。但目前對藥物性肝損傷的研究主要停留在個別藥物中，由于損傷機制差別等原因難以找到共同差異代謝物，而對于共同生物標志物的篩選及代謝物組的考察也逐漸成為研究熱點。

3 減毒及肝損傷修復作用研究

隨著代謝組學技術在醫藥研究領域的不斷發展和深入，它在聯合用藥、增效減毒方面也有一些應用。通過代謝組學研究發現，清絡通痹方中等效劑量的生地黃和三七可分別通過調控甘氨膽酸和硫胺素等代謝產物來減輕雷公藤的肝臟毒性；占雷公藤劑量1／3的甘草主要通過影響甘油磷脂代謝，從而達到配伍減毒雷公藤的功效[40-41］。

對乙酰氨基酚作為最常用的解熱鎮痛藥，其肝毒性也同樣被廣泛關注。Fukuhara等[42］通過1H-NMR對大鼠血清和尿液進行內源性代謝物譜監測，驗證苯巴比妥可誘發和加重對乙酰氨基酚的肝臟毒性，其氧化應激可明顯影響N-乙酰基-對苯醌的代謝；Kyriakides等[17］通過對乙酰氨基酚和其毒性較小的同分異構體glutathionyl進行代謝組學分析和病理觀察，證實乙酰氨基酚主要通過對氨基酸代謝的擾亂來影響線粒體和糖代謝，導致能量中斷，從而造成肝損傷，而glutathionyl未產生變化，證明它對乙酰氨基酚有減毒作用，可作為其替代藥物，另外給予9、36 g生藥／kg的柴胡均可通過調節糖代謝、脂質代謝和能量代謝的可以改善 500 mg／kg對乙酰氨基酚的肝臟損傷[43］。

代謝組學技術在藥物保肝作用機制研究方面也有所應用。例如，1.6 g／kg巖黃連可恢復30 mg／kg四氯化碳所致的丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝、甘油三酯代謝的異常[44］；聯苯雙酯可將馬兜鈴酸、大黃素等造成肝損傷的代謝異?；謴偷秸Ｋ絒45］；王小娟[46］對川楝子及其主要提取部位與白芍配伍后的肝臟毒性進行NMR技術分析后發現，該藥材主要毒性部位為乙酸乙酯提取物，它與白芍按1∶2比例配伍時能在一定程度上減輕其肝臟毒性。

目前，基于單味中藥肝臟毒性的研究較多。利用代謝組學技術，以復方制劑為研究對象，從整體上闡釋中藥所致肝損傷及中醫藥減毒保肝機制，可為中藥臨床配伍及劑量使用提供科學參考，對中藥現代化具有積極意義。

4 總結與展望

代謝組學技術由于其研究特點和優勢，經過多年的探索和應用被廣泛用于藥物研發、毒性評價、臨床疾病診斷等領域。在藥物性肝損傷的早期預警及防治方面，代謝組學具備更好的可靠性、預見性，又能在疾病的早期發現、機制研究及藥物安全性評價等方面發揮重要作用[21］。但目前代謝組學仍有很多需要完善的地方，如建立一個較完整的代謝物庫仍需要一定時間，而個體差異、環境等外在因素很容易影響代謝物的變化和差異。另外，由于藥物性肝損傷類型復雜多樣，所找到的差異代謝物也各有不同，難以僅通過1個或幾個代謝物作為潛在生物標志物進行診斷。因此，如何建立差異代謝組以更好地適應臨床治療和藥物開發仍是研究熱點。

目前，代謝組學技術在藥物性肝損傷的應用仍主要集中在臨床前研究，尚無法用于臨床診斷和治療，但已逐漸向臨床研究和應用轉移，故可嘗試通過該技術為相關研究提供幫助。由于藥物性肝損傷機制復雜，如何利用代謝組學技術將其類型合理分類，分析其主要潛在差異代謝物和毒性機制，將成為今后相關研究的重點。隨著質譜技術、大數據分析、代謝數據庫等的不斷完善，代謝組學技術在藥物性肝損傷診斷、毒性機制及治療中的應用也將有會突破性進展。