間充質(zhì)干細(xì)胞在膿毒癥的應(yīng)用研究進(jìn)展

周婷，史家欣，李小民

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院 1.急診科，2.呼吸內(nèi)科，江蘇 連云港 222002)

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]，可在感染后進(jìn)一步發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致促炎與抗炎機(jī)制失衡、細(xì)胞凋亡、組織器官損傷等。盡管近年重癥醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展[2]，并在治療方面取得較大進(jìn)展，但全世界每年發(fā)病率持續(xù)升高[3]，病死人數(shù)居高不下[4]，膿毒癥的常規(guī)治療方法并未取得明顯效果，新的治療手段亟需出現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種免疫治療措施，在免疫調(diào)節(jié)、抗菌、調(diào)節(jié)器官衰竭、抗凋亡、抗炎癥小體等方面起到重要作用，并在治療膿毒癥方面取得較多進(jìn)展[5-7]，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC）有望成為治療膿毒癥的新型候選藥物。本文就MSCs 在膿毒癥治療方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 概述

膿毒癥極難治療且是主要公共衛(wèi)生問題之一。在膿毒癥發(fā)展過程中，解決最初原發(fā)病感染后，免疫失衡可以持續(xù)存在，這主要是由損傷相關(guān)分子模式，其與模式識別受體相互作用，進(jìn)一步激活促炎小體的組裝，其介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的釋放，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF-α）、白細(xì)胞介 素-1（interleukin 1, IL-1）、IL-6、IL-18 和IL-10[8]，引起炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，促炎抗炎反應(yīng)的失衡，同時免疫功能紊亂、細(xì)胞自噬及凝血異常等發(fā)生[9]，可導(dǎo)致機(jī)體對感染反應(yīng)失調(diào)和器官功能障礙，可進(jìn)一步發(fā)展成為膿毒癥，引起機(jī)體損傷。免疫功能受損是膿毒癥發(fā)展過程中主要病理生理機(jī)制，若能根據(jù)其進(jìn)行突破，可為膿毒癥治療提供有效的手段。

目前膿毒癥治療大多為支持治療，如抗生素使用及血管活性藥物支持，但仍無特異性治療藥物。盡管臨床試驗(yàn)及臨床前實(shí)驗(yàn)正在研究膿毒癥治療藥物，包括IL-1 受體拮抗劑[10]、人重組活化蛋白C[11]和靜脈注射免疫球蛋白G[12]，但仍沒有新的藥物在臨床常規(guī)使用[13]。MSCs 是來源于中胚層的干細(xì)胞，可從脂肪、臍帶血、骨髓、胎盤、臍帶中提取。MSCs 能夠細(xì)胞與細(xì)胞接觸以及釋放可溶性旁分泌因子包括一氧化氮、吲哚胺2，3-雙加氧酶、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β 和IL-10 調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[14-16]。自2016年開始，MSCs 應(yīng)用于膿毒癥臨床前期及早期臨床試驗(yàn)數(shù)量劇增，其良好的治療效果與其抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性、減少細(xì)胞凋亡等相關(guān)[7-8]。

2 MSCs 治療膿毒癥的理論基礎(chǔ)

隨著對膿毒癥免疫治療的不斷研究，間充質(zhì)干細(xì)胞諸多特性在膿毒癥治療方面引起人們注意，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗菌、調(diào)節(jié)器官衰竭、抗凋亡等，在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展各個階段起重要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，為其治療膿毒癥提供更多的可靠性，也為探究膿毒癥安全有效的治療措施提供機(jī)會。

2.1 免疫調(diào)節(jié)

免疫抑制或免疫麻痹的免疫失衡狀態(tài)是膿毒癥發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制，主要表現(xiàn)為抗炎反應(yīng)與促炎反應(yīng)失調(diào)。先天性和適應(yīng)性免疫改變、T 細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等免疫反應(yīng)失控，引起抗炎因子和促炎因子分泌紊亂，炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生。MSCs 通過多種機(jī)制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用：①M(fèi)SCs 可通過免疫系統(tǒng)細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子合成、并在可溶性因子以及細(xì)胞間相互作用介導(dǎo)下調(diào)節(jié)炎癥，從而影響先天性和適應(yīng)性免疫，進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)[17]；②MSCs 可通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）免疫活性[18]、促進(jìn)抗炎因子IL-10 表達(dá)等[19]在膿毒癥發(fā)展過程中進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。③MSCs 的免疫調(diào)節(jié)特性可被外泌體中所含的抗炎外泌體微小RNA-146a（miR-146a）水平增強(qiáng)，可能是抗炎miR-146a 被IL-1b 刺激和選擇性強(qiáng)烈上調(diào)，同時miR-146a 轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞，選擇性活化M2 型巨噬細(xì)胞極化，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[20]。

2.2 抗菌

機(jī)會性致病菌或者毒力較弱的細(xì)菌在機(jī)體免疫功能正常時對機(jī)體不構(gòu)成威脅，吞噬細(xì)胞（單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）可吞噬相關(guān)致病菌從而保護(hù)機(jī)體，而膿毒癥發(fā)生后機(jī)會性致病菌進(jìn)入體內(nèi)，造成機(jī)體感染。MSCs 具有抗菌作用：①M(fèi)SCs 可通過抑制吞噬細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其吞噬功能，從而發(fā)揮抗感染作用[21]；②MSCs 通過分泌抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）和蛋白質(zhì)間接和直接機(jī)制發(fā)揮強(qiáng)大的抗菌作用[22]；③MSCs[23]可間接地分泌多種因子如IL-10、PGE 等，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌及自身抗炎能力，清除細(xì)菌；④MSCs[24]增加肺泡抗菌肽LL-37 濃度，增加細(xì)菌清除率。

2.3 調(diào)節(jié)器官衰竭

多器官功能衰竭（multiple organ failure, MOF）是膿毒癥嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是膿毒癥危及生命靶點(diǎn)時間之一，組織器官損傷、臟器功能受損是MOF 主要臨床表現(xiàn)，病情多在其出現(xiàn)后惡化，組織器官的修復(fù)顯得尤為重要。MSCs 通過多種途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)器官衰竭作用：①M(fèi)SCs[25]能夠提高超氧化物歧化酶水平，從而有效保護(hù)機(jī)體抗氧化能力，發(fā)揮保護(hù)臟器功能的作用；②MSCs 分泌的微泡（microvesicle, MV）可體減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型肺部炎癥，主要因?yàn)镸SCs MV 含有大量血管生成素-1 信使核糖核酸（mRNA），其在血管穩(wěn)定和消除炎癥中起重要作用，如引起TNF-α 水平的降低，從而進(jìn)一步減輕膿毒癥小鼠肺損傷[26]；③MSCs[7]可增加抗衰老蛋白Klotho的表達(dá)，同時減少大鼠腎臟和肺組織的細(xì)胞凋亡，抗細(xì)胞凋亡作用可能與核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor-κB）抑制有關(guān)。抑制NF-κB 可減少多種促炎基因的表達(dá)，減少血管內(nèi)凝血，減少組織中性粒細(xì)胞流入，并防止微血管內(nèi)皮細(xì)胞滲漏，從而保護(hù)臟器功能。④經(jīng)脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）預(yù)處理的MSCs 可極大改善MSCs 的旁分泌和再生修復(fù)特性，減輕臟器細(xì)菌負(fù)荷，調(diào)節(jié)機(jī)體對器官損傷的免疫反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)器官功能[27]。

2.4 抗凋亡

膿毒癥可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞功能喪失，同時導(dǎo)致免疫效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量減少，與凋亡細(xì)胞的免疫抑制作用相結(jié)合進(jìn)而使免疫麻痹，是膿毒癥患者發(fā)病率和死亡率上升的主要原因[28]。B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）家族是細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)分子，既有抗凋亡蛋白，也有促凋亡蛋白，抗凋亡作用蛋白Bcl-2具有保護(hù)細(xì)胞的功能，Bcl-2 的過度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱苷肽的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase）的活性，可抑制內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。促凋亡蛋白Bax 是Bcl-2 家族中參與細(xì)胞凋亡的成員，當(dāng)誘導(dǎo)凋亡時，從胞液遷移到線粒體和核膜，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MSCs 具有抗凋亡作用：①M(fèi)SCs 可減少腎臟和肺組織的細(xì)胞凋亡，降低Bax表達(dá)，可能與NF-κB 表達(dá)有關(guān)[7]；②MSCs 可降低Caspase-3 和Bax 表達(dá)及增加Bcl-2 表達(dá)，主要通過下調(diào)磷酸化糖原合酶激酶-3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3 beta, p-GSK-3β）和β-連環(huán)蛋白進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞減少凋亡[29]。

2.5 抗炎癥小體

病原體感染后，損傷相關(guān)分子模式與模式識別受體相互作用，進(jìn)一步激活促進(jìn)炎癥小體的組裝，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)。NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體作為炎癥小體的一種，可促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 釋放，同時可調(diào)節(jié)胱冬肽酶-1（Caspase-1）活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30]。NLRP3 炎癥小體活化后，可致線粒體損傷[31]，同時產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species, ROS），線粒體DNA 被釋放，可進(jìn)一步激活NLRP3 炎癥小體[32]。自噬是一種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，可降解損傷細(xì)胞器或者異常蛋白進(jìn)行穩(wěn)態(tài)維持。近期研究表明，自噬可降解炎癥小體，還可清除線粒體從而減少其釋放DNA 及ROS，最終負(fù)調(diào)控NLRP3 炎癥小體[33]。MSCs 可通過增加線粒體自噬和減少線粒體ROS 來限制巨噬細(xì)胞中炎癥小體激活[34]。

3 MSCs 治療膿毒癥的動物研究

MSCs 的大量基礎(chǔ)研究已顯示出其對膿毒癥具有保護(hù)作用，一系列國內(nèi)外關(guān)于MSCs 對膿毒癥的動物實(shí)驗(yàn)研究早已開展。一項(xiàng)較早的動物實(shí)驗(yàn)[35]將LPS注入大鼠腹腔內(nèi)誘導(dǎo)大鼠膿毒癥模型，并在模型形成后立即將MSCs 注射至左大腿肌肉中，結(jié)果顯示，MSCs 通過減少各種靶器官中炎癥細(xì)胞的浸潤和減少細(xì)胞死亡來減輕損傷。接著，CóNDOR 等[7]采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture, CLP）形成大鼠膿毒癥模型，并在CLP 術(shù)后6 h 后將MSCs 注入大鼠腹腔內(nèi)，結(jié)果顯示，MSCs 可改善大鼠腎小球?yàn)V過率及管狀功能、降低CD68（巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)及減少分?jǐn)?shù)間隙面積，降低NF-κB 和細(xì)胞因子的表達(dá)下降，增加血管內(nèi)皮生長因子和Klotho 的表達(dá)，減輕腎臟細(xì)胞凋亡，同時改善肝功能及增加肝臟中的糖原沉積，并提高生存率。另一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)[19]在CLP 術(shù)后1 h 將MSCs 注入大鼠腹腔內(nèi)，結(jié)果顯示，MSCs 可在膿毒癥早期通過降低促炎因子水平促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生，并且T 輔助細(xì)胞（T helper, Th）Th/Th2 比例正常，同時增加抗炎因子水平，改善敗血癥免疫功能狀態(tài)，但不能提高動物生存率。

4 MSCs 治療膿毒癥的臨床研究

臨床前研究結(jié)果提示MSCs 有望成為治療膿毒癥的新型藥物，與之相關(guān)的臨床研究開始出現(xiàn)，但目前只有有限的報告詳細(xì)說明MSCs 應(yīng)用于人類，且病例數(shù)較少，仍有較多正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。WILSON 等[36]在美國多中心進(jìn)行的隨機(jī)對照Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，將9例中重度急性呼吸窘迫綜合征患者按照骨髓MSCs 治療順序分為3組，每組3例，分別接受0.1×107、0.5×107和1.0×107個/kg 的單次靜脈內(nèi)輸注，結(jié)果顯示：9 例 患者中均未報告預(yù)先指定的輸液相關(guān)事件或治療相關(guān)不良事件（adverse event, AE）。然而在輸注后的幾周內(nèi)，3 例患者隨后發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良事件：1 例患者在研究第9 天死亡，1 例患者在研究第31 天死亡。這些嚴(yán)重不良事件均未被認(rèn)為與MSCs 相關(guān)。基于這一階段的經(jīng)驗(yàn)，作者已經(jīng)開始進(jìn)行2 期測試，其研究結(jié)果作者會繼續(xù)跟蹤。MCINTYRE 等[37]在加拿大膿毒性休克中進(jìn)行MSCs 的隨機(jī)對照I 期劑量遞增試驗(yàn)（NCT02421484）中，將9 例膿毒癥休克患者分為3 組，每組3 例，分別予0.3×106、1.0×106和3.0×106個/kg 的單次靜脈內(nèi)劑量輸注骨髓MSCs 進(jìn)入膿毒癥患者體內(nèi)，結(jié)果顯示：與正常對照組比較，未出現(xiàn)MSCs 輸注相關(guān)或嚴(yán)重意外的AE，且每公斤300 萬個細(xì)胞（2.5 億個細(xì)胞）的劑量似乎是安全的。HE 等[38]首次檢測單劑量同種異體臍帶MSCs 在嚴(yán)重膿毒癥患者中的安全性和可行性，并在我國近期進(jìn)行的單中心的隨機(jī)對照I期臨床實(shí)驗(yàn)（ChiCTR-TRC-14005094）中，將15 例患者分為3 組，每組5 例，分別予1×106、2×106和3×106個/kg MSCs 靜脈注射，結(jié)果顯示：與歷史病例匹配的比較組比較，輸入臍帶MSCs 后該試驗(yàn)中15 例患者均未發(fā)生輸液相關(guān)嚴(yán)重事件或治療相關(guān)不良事件，對嚴(yán)重不良事件或測量的細(xì)胞因子，也沒有任何安全性或有效性。在15 例嚴(yán)重膿毒癥患者中，單次靜脈輸注同種異體MSCs，劑量為3×106個/kg 時安全且耐受性良好，但仍未能得出MSCs 治療嚴(yán)重膿毒癥療效的結(jié)論。目前該團(tuán)隊(duì)正在70 例患有嚴(yán)重膿毒癥的患者中予以3×106個/kg 劑量輸注MSCs 進(jìn)行一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲安慰劑對照的2 期臨床試驗(yàn)，旨在主要關(guān)注其安全性和次要結(jié)果，包括存活率和系統(tǒng)終點(diǎn)，作者會持續(xù)關(guān)注。

越來越多的研究顯示，MSCs 是較大希望治療膿毒癥的新型療法之一。但MSCs 治療安全性等一系列問題，使MSCs 應(yīng)用到膿毒癥的臨床治療還需要一個過程。因此，MSCs 作為一種新的治療方式，仍需要進(jìn)一步深入研究和探索，如在臨床環(huán)境中利用MSCs 應(yīng)考慮MSCs 生物學(xué)的細(xì)微差異，包括給藥時機(jī)、途徑、劑量等，只有對MSCs 的安全性和效果進(jìn)行評估后，才能真正將MSCs 有效地用于臨床治療。