淺談異分化在放射誘導肺纖維化中的作用*

[河南省人民醫院（河南大學人民醫院） 腫瘤內科，河南 鄭州 450003]

放射性肺纖維化成為胸部放射治療后的嚴重并發癥，因其機制不明，無早期診斷指南，也無有效標準的治療方法，最終導致呼吸衰竭。基于國內外對放射性肺纖維化機制的多種假說，本課題組提出Ⅱ型肺泡干細胞在放射誘導下異分化為肌成纖維細胞，通過復制放射性肺纖維化小鼠模型，運用形態學和分子學方法進行驗證，以期進一步明確肺纖維化的可能機制，為纖維化的診療奠定基礎。

1 放射治療的機制

放射治療是指用離子射線治療惡性腫瘤（有時也可治療良性病變）的臨床策略，其射線種類有α射線（氦原子核）、β（電子）、X/γ射線（光子）及質子。目前，用于腫瘤治療的離子射線主要是X射線或γ射線。質子治療儀因價格昂貴和治療費用高而較少在臨床使用。這些射線可將能量直接作用于生物大分子上，引起生物大分子電離和激發；也可先作用于水，使水分子產生一系列輻射分解產物（OH、H、e-、H2及H2O2等氧化物），再作用于生物大分子，這些都能導致機體的核酸、蛋白質及酶類分子結構改變和活性喪失，從而導致腫瘤細胞死亡，起到治療作用[1]。但射線同時也會對正常組織造成損傷，在肺組織中，不同類型細胞對射線的敏感性存在差異，以肺上皮細胞最為敏感。

2 肺上皮細胞修復

肺組織可分為實質和間質兩部分：實質即肺內支氣管各級分支及其終末的大量肺泡；間質包括肺內結締組織及其中的血管、淋巴管及神經。肺泡是支氣管樹的終末部分，肺泡璧由單層肺泡上皮組成，肺泡上皮主要為I型和Ⅱ型上皮細胞。I型細胞負責氣體交換及調節肺泡中液體穩態，占肺泡表面積的95%；另外5%則是Ⅱ型肺泡細胞，其作用是通過分泌表面活性物質來維持穩定肺泡大小與結構。因肺與外界相通，極易受到外部有害物質的損傷，如氧化應激和毒性損傷。而I型細胞是終末細胞，不具有分裂增殖能力，其損傷丟失可依賴Ⅱ型上皮細胞的分化、分裂獲得修復補充[2]。因此，肺Ⅱ型細胞被公認為肺上皮成體干細胞（adult stem cells,ASC）[3]。此外，肺細支氣管上皮層內也含有可分裂、分化為細支氣管上皮的成體干細胞，即Clare細胞。

3 ASC 及其微環境

干細胞的微環境對保留干細胞未分化狀態具有重要意義。THOMSON等[4]于1998年從囊胚階段的小鼠胚胎中分離出胚胎干細胞（embryonic stem cell,ESC），在組織培養中無限增殖并不喪失多能性的潛能。然而在體外組織培養時，ESC釋放潘多拉盒子的分化程序，形成丑陋的多細胞腫塊，稱為畸胎瘤。與此相反，MARTIN[5]在70年代將ESC注射到小鼠胚泡中心，類似于天然生態位，ESC恢復正常使命，并有利于ESC產生正常的組織后代。因此，干細胞內在分化表型特征由其微環境決定。成體干細胞也同樣依賴其微環境，卵巢生殖干細胞微環境是一種穩定結構，能誘導成體干細胞分化為卵泡細胞，使相對早期階段的異位卵泡祖細胞去分化[6]。最近的研究表明，這些微環境提供其擴散、分化或保持休眠的信號[7]。細胞的相互作用是通過粘附或間隙連接調節ASC保留和分布[8]；細胞外基質（extracellular matrixc,ECM）組成三維細胞外網絡，通過形成保護和營養生物物理過濾器，作為促進免疫反應、血管生成和組織再生的媒介[9]；可溶性蛋白因子通過改變其局部有效濃度、生物利用度和穩定性，從而調節對靶細胞的作用，如成纖維細胞生長因子-2、Wnt3、Notch及轉化生長因子 -β（transforming growth factor-β,TGF-β）等[10-11]。

4 TGF-β 與肺纖維化

TGF-β是一種多效能因子，1985年首次被ASSOIAN等[12]從人血小板中分離出來，到目前已發現TGF-β的6個亞型，而哺乳動物中僅發現TGF-β1、TGF-β2及 TGF-β3。KHALIL等[13]1991年 發 現，TGF-β在肺纖維化發生過程中起重要作用。其中，TGF-β1作用更加顯著。現有大量基礎實驗和臨床研究表明，TGF-β1是重要的致纖維化細胞因子之一，發現該因子在肺纖維化組織中高表達[14]。DAS等[15]通過在體和離體實驗發現，無論在人細胞株還是小鼠中，TGF-β1都有很強的促纖維化作用。P17是一種TGF-β抑制劑，在IMR-90人胚肺成纖維細胞和小鼠肺纖維化模型中能抑制TGF-β介導的肺纖維化[16]。此外，通過對人類特發性肺纖維化的研究發現，抗纖維化藥物干擾素-γ（interferon-gamma IFN-γ）能降低肺組織中TGF-β水平[17]。有關TGF-β誘導肺纖維化的機制復雜，但PANDIT等[18]研究結果顯示，TGF-β 可下調 Let-7 miRNA。而 Let-7 miRNA 的下調可誘導小鼠肺Ⅱ型上皮干細胞表達間質細胞標志物，肺泡間隔增厚，膠原合成增加，纖維化發生[18]，提示TGF-β導致肺纖維化的機制可能是通過下調Let-7 miRNA實現。

5 Let-7 miRNA 與肺纖維化

MicroRNA（miRNA）是長約 22 nt非編碼 RNA，廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中。這些miRNA可通過3’非翻譯區的互補位點與靶mRNA結合，通過mRNA降解抑制靶蛋白產生[19]。因此，miRNA是基因表達的關鍵調控因子[19]，如miRNA-126通過調節Toll樣受體2/4信號通路中的TOMI，參與囊性纖維化[20]。miRNA-192以Smad3依賴的方式介導腎纖維化[21]。用博來霉素誘導的纖維化組織中有161種miRNA表達差異[22]。直接照射或暴露于氧化應激的藥物時，miRNA微陣列分析表明組織中許多miRNA被上調或下調，特別是Let-7家族的miRNA可能對氧化應激的反應更為顯著[23]。在40個特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）組織和20個對照肺組織微陣列上進行原位雜交，顯示IPF中Let-7 miRNA降低[24]。提示Let-7 miRNA為正常干細胞所必需，因為上調Let-7 miRNA可完全恢復干細胞正常表型[25]。進一步研究發現let-7 miRNA是Wnt/β-catenin信號轉導途徑的靶分子，其表達受Wnt/β-catenin的抑制[25]。

6 Wnt/β-catenin 途徑與肺纖維化

Wnt信號傳導途徑可分為決定細胞命運的經典途徑、控制細胞運動及組織極性的非經典途徑。Wnt/β-catenin途徑是通過β-catenin的核內移位，從而激活靶基因的轉錄活性。Wnt/β-catenin途徑啟動信號級聯反應，在腦、腸、皮膚及肺等正常組織的發育起著關鍵性的作用[26]。Wnt途徑在乳腺癌中可增強乳腺癌干細胞的擴增[25]。IPF組織中微陣列分析顯示與Wnt/β-catenin通路有關基因被上調[27]。同時對IPF患者肺Ⅱ型細胞更詳細地分析發現，Wnt信號通路中相關的靶蛋白都有增加[28]。期間涉及的潛在分子途徑尚未完全確定，但通過使用mRNA微陣列篩選測定法，已鑒定Let-7 miRNA作為Wnt-β-連環蛋白途徑的下游靶標[25]。該過程通過激活Lin28蛋白，使Let-7 precursor miRNA 轉化為 Let-7 mature miRNA 的過程受抑制實現[25]。因而筆者提出，在肺纖維化發生時，可能存在 TGF-β-Wnt/β-catenin-Lin28-let-7 miRNA調控軸。

7 肌成纖維細胞與肺纖維化

IPF患者中，ECM含量是正常肺組織的2～3倍，其主要由膠原纖維（Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ及Ⅶ）、纖連蛋白、彈性蛋白及蛋白多糖組成，大量肺纖維化研究證實，肌成纖維細胞是膠原和ECM的最主要來源[29]。正常的傷口愈合后期，成纖維細胞和肌成纖維細胞通過凋亡來減少。但在IPF患者中特別是纖維化病灶中，成纖維細胞和肌成纖維細胞數量保持不變[30]。有研究表明，在IPF組織中成纖維細胞或肌成纖維細胞數量越多，預后越差[31]。近年來許多學者認為肌成纖維細胞有3種來源[32]：①器官自身:基質成纖維細胞；②骨髓“纖維細胞”；③上皮間質轉化。以上3種假設未被證實，然而目前不同原因導致的纖維化肌成纖維細胞確切來源還不清楚。

綜上所述，肺組織上皮在胸部放療過程中會造成一定的損傷，正常情況下通過Ⅱ型肺泡上皮干細胞的增殖、分化進行修復。肺纖維化患者中，上皮細胞沒有得到補充修復，而為膠原和ECM所取代。纖維化組織中 TGF-β、Let-7 miRNA、Wnt/β-catenin途徑中相關的靶蛋白、肌成纖維細胞都有改變。同時已證實 TGF-β 可下調 Let-7 miRNA，而 Let-7 miRNA又受到Wnt/β-catenin途徑抑制（該過程通過激活Lin28蛋白實現）。筆者可假設放射導致TGF-β升高，通過Wnt/β-catenin途徑激活Lin28蛋白，抑制成熟Let-7 miRNA形成，使肺泡Ⅱ型干細胞在缺乏Let-7miRNA的情況下沒有正常分化，而異分化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞又進一步產生ECM，從而導致肺纖維化的發生。然而假設需要被證實，希望筆者接下來的課題能確認TGF-β、Wnt/β-catenin及Let-7 miRNA相關性，同時闡明肺纖維化發生的確切機制。