慢性束縛應激對小鼠胃食管的影響

買買提·依斯熱依力 吾布力卡斯木·吾拉木 艾克拜爾·艾力 李義亮 阿孜古麗·阿力木江 阿麗葉古麗·艾皮熱 巴突爾·艾克木 蔣媛 趙新勝 阿卜杜薩拉木·阿卜杜合力力 克力木·阿不都熱依木

隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，生活和工作壓力在無形中影響著人類的心身健康，同時也更加客觀地體現(xiàn)在一些生理疾病上，比如胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)。臨床研究報道焦慮、抑郁等精神因素可導致反流癥狀的加重[1]；急性應激可加重胃食管反流病患者的燒心癥狀[2]。動物實驗亦證實，心理或軀體應激與胃腸道功能紊亂有密切的聯(lián)系，同樣在GERD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[3-4]。根據(jù)最新的流行病學研究報道，雖然GERD發(fā)病率在不同地區(qū)存在差異，但幾乎在所有地區(qū)呈逐年上升趨勢[5]。因此，GERD發(fā)病率的增加與日益受重視的心理因素之間的聯(lián)系有待深入研究。本實驗通過建立小鼠慢性束縛應激(chronic restraint stress，CRS)模型，探討心理應激所引起的下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸相關(guān)激素及胰島素分泌功能的變化及其對胃食管黏膜的組織學影響，為后期進一步研究心理因素在GERD發(fā)生、發(fā)展的機制提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、一般材料

1. 實驗動物及分組：SPF級雄昆明小鼠25只，8周齡，購于新疆實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(新)2011-0001；飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動物中心。25只小鼠進行編號及體重測量，并排除體重變異較大的5只。采用Microsoft Office Excel軟件隨機分2組(各10只)，即慢性束縛應激(CRS)組和正常對照(normal control，NC)組。小鼠單只飼養(yǎng)在自由進食水的鼠籠內(nèi)，每日給予12 h晝夜循環(huán)，光照均始于8∶30分，止于20∶30分

2. 實驗器材及主要試劑：自制式束縛器；電子天平(EL-5.2K)，常州市天之平儀器設備有限公司；低溫高速離心機(1-14K)，德國Sigma公司；光學顯微鏡(Eclipse E200)，日本尼康公司；三諾安穩(wěn)血糖儀及血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司；小鼠促腎上腺激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)，促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotrophic hormone,ACTH)、皮質(zhì)醇(Cortisol,CORT)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，上海江萊生物科技有限公司；D-葡萄糖，德國Sigma公司；HE染色相關(guān)試劑，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1. CRS模型的建立：正式實驗前，將所有小鼠在相同環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周。模型開始建立后，所有束縛應激均在每日上午10∶30～12∶30(北京時間)進行，以盡量減少生理周期的影響。10只CRS組小鼠置于用50 ml離心管所制的自制式束縛器中(離心管提前燙制出直徑約5 mm的通氣孔若干，分布于左右及上側(cè)管壁，管口塑料蓋做1小孔以暴露小鼠尾巴，圖1)，每日限制活動2 h，期間禁食禁水，后放回鼠籠內(nèi)自由活動，連續(xù)束縛14 d。NC組小鼠自由飲水攝食，其余時間2組小鼠處理相同。

2. 取材與標本處理：束縛應激第14日下午17∶00(北京時間)開始對所有小鼠禁食，于次日11∶00(北京時間)進行取材。將麻醉的動物以平臥位固定，從腹部正中至劍突取切口取3 cm切口，下腔靜脈取血注入于1.5 ml EP管中。在距離胃食管交界處0.3和1.5 cm處剪斷取材，置于4%中性甲醛固定。

3. 檢測血清中HPA軸相關(guān)激素的含量：取血后不經(jīng)任何處理，4 ℃下靜置2 h，之后以3500 rpm/min的速度低溫離心5 min，取上層血清，-80 ℃保存，用于后續(xù)血激素測定。ELISA法檢測HPA軸相關(guān)激素，即CRH、ACTH、CORT的含量。實驗過程及測量指標濃度的計算嚴格按試劑盒說明書進行。

4. 葡萄糖耐受試驗(GTT)與胰島素耐受試驗(ITT)：參照文獻進行試驗，大體步驟如下：第14 d的束縛應激結(jié)束后，所有小鼠需禁食16 h，可正常飲水，于第15 d取材前進行試驗[6-7]。GTT：試驗開始前測血糖濃度，然后腹腔內(nèi)以2 g/kg的量注射D-葡萄糖，并在注射后30、60、90、120 min分別監(jiān)測血糖；ITT實驗：GTT試驗結(jié)束后向小鼠腹腔內(nèi)注射胰島素0.75 U/Kg，其后分別在15、30、45、60 min分別檢測血糖并記錄。

注：圖1.a:2組小鼠適應性喂養(yǎng)階段；b:2組小鼠束縛應激開始前比較；c:2組小鼠束縛應激結(jié)束后比較；d:2組小鼠應激結(jié)束后大便形狀比較。NC為正常對照組；CRS組為慢性束縛應激組

圖1 慢性束縛應激模型的建立過程

a.ACTH促腎上腺皮質(zhì)激素 b.CRH促腎上腺激素釋放激素 c.Cortisol皮質(zhì)醇

注：a為2組小鼠血清AcTH濃度比較；b為2組小鼠血清CRH濃度比較；c為2組小鼠血清Cortisol濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)NC為正常對照組；CRS組為慢性束縛應激組；HPA為下丘腦-垂體-腎上腺

圖2 CRS對HPA軸相關(guān)激素的影響

5. 食管組織病理學檢查：4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片行HE染色。切片質(zhì)量及食管、胃組織形態(tài)學改變均由富有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師診斷。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、CRS對小鼠體重和進食量的影響

體重為反應小鼠機體整體狀況的基本指標。實驗開始前CRS組小鼠體重為(25.0±1.6)g，NC組小鼠體重為(24.0±1.5)g，2組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；14 d的實驗過程中，CRS組小鼠平均每日進食量為(13.5±1.3)g，顯著低于NC組(13.4±1.4)g，2組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗結(jié)束后CRS組小鼠體重增加量為(8.6±3.1)g，NC組小鼠體重增加量為(12.5±3.0)g，2組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CRS組小鼠異常的進食量和體重增加量說明，實驗組小鼠受到應激的影響，機體一般狀況下降。

注：NC為正常對照組；GTT為×××耐受試驗；CRS為慢性束縛應激組；ITT為胰島素耐受試驗

二、CRS對小鼠血清HPA軸相關(guān)激素含量的變化

小鼠在14 d的慢性應激后，檢測血清中HPA軸相關(guān)激素(CRH、ACTH、CORT)水平發(fā)現(xiàn)，CRS組小鼠的三種激素水平明顯高于NC組小鼠，2組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2)。

三、CRS對小鼠糖耐量和胰島素耐量的變化

GTT結(jié)果顯示，試驗開始之初NC組和CRS組小鼠血糖上升明顯，并且2 h之內(nèi)恢復之前的濃度，提示2組小鼠未見糖耐量異常。ITT結(jié)果顯示，NC組小鼠血糖濃度有1次較大幅度的下降，2 h內(nèi)能夠恢復正常范圍內(nèi)的濃度；而CRS組小鼠的血糖雖然有下降，但2 h內(nèi)未能恢復到正常范圍之內(nèi)，提示可能存在胰島素抵抗。經(jīng)計算曲線下面積得知，CRS組胰島素耐受在整體水平上與NC組小鼠具有顯著差異(P<0.05，圖3)。

四、CRS對胃、食管黏膜組織學的影響

HE染色鏡下觀察可見：食管粘膜層赤可見，基底細胞增生，固有層乳頭延長，中性粒細胞，淋巴細胞以及漿細胞浸潤，炎癥性改變(圖4)，這些均為食管上皮受到外界因素損傷后的表現(xiàn)及增生修復反應。但NC組未見明顯異常。

討 論

GERD作為全球范圍內(nèi)流行的消化道常見病，其在不同地區(qū)的發(fā)病率存在差異。根據(jù)最新的流行病學研究報道，在歐洲GERD發(fā)病率為8.8%～25.9%，在美洲為18.1%～27.8%，在東亞和中東地區(qū)分別為2.5%～7.8%、8.7%～33.1%；并且1995年以來GERD發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尤其在東亞地區(qū)增長速度較快[5]。另有研究表明，目前在發(fā)達國家中每個星期出現(xiàn)至少一次GERD癥狀的人約占10%～20%，這也被認為是降低工作效率和增加缺工次數(shù)的原因之一，被視為一大公共健康問題[8-9]。因此GERD發(fā)病率的增加和其對人類生活影響的越來越明顯，驅(qū)使著讓更多的研究揭示GERD發(fā)生、發(fā)展的機制。

注：NC為正常對照組；CRS為慢性束縛應激組

目前眾多研究已證實，心理應激在GERD發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用[3,10-11]。根據(jù)內(nèi)鏡下有無食管黏膜損傷，可將GERD分為3種類型：非糜爛性反流病(non-erosive reflux disease,NERD)、糜爛性食管炎(erosive esophagitis，EE)、Barrett食管(Barrett′s esophagus，BE)[12-13]。通過內(nèi)鏡與組織學檢查發(fā)現(xiàn)，將近60%的GERD患者食管黏膜未見明顯病變[14]，屬于NERD患者。然而在研究心理應激在GERD發(fā)生發(fā)展機制研究中作用時，往往因不易獲取倫理批準或患者知情同意、無法及時全面觀察機體病理生理變化及各層組織形態(tài)學變化等因素而難以實現(xiàn)，而動物實驗模型的成功建立解決了上述問題。

相比于其他心理應激動物模型，如避水應激、擁擠應激及母嬰分離應激，束縛應激作為一種非損傷性刺激，能夠較好地模擬人類生活中“無法控制”的心理狀態(tài)，既與人類產(chǎn)生應激及其導致的心身性疾病過程相似。因此，目前束縛應激模型被廣泛研究者所使用并取得了理想的成果。本實驗我們采用小鼠慢性束縛應激模型，初步探討心理應激與GERD的相關(guān)性。

根據(jù)國外研究者的實驗結(jié)果，小鼠慢性束縛應激模型的成功建立通過實驗動物體重、飲食量、HPA軸相關(guān)激素水平及其他重要內(nèi)分泌器官(胰腺)功能的變化來決定[15]。體重作為反應小鼠精神及身體總體狀況最基本的指標，束縛應激對其有明顯的影響。與此同時，以往的研究普遍認為下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)在機體的應激反應中起著核心作用，而其作用又通過與其它各系統(tǒng)之間的交互作用得以實現(xiàn)[16]。應激狀態(tài)下，體質(zhì)量明顯降低，抑制體質(zhì)量增長原因較多，其中皮質(zhì)醇升高是其重要因素[17]。也有研究顯示，小鼠在慢性精神應激后食欲、體溫、內(nèi)分泌代謝功能都會出現(xiàn)紊亂[18]。我們的實驗結(jié)果表明，雖然2組小鼠平均每日飲食量無顯著差異，但CRS組小鼠HPA軸相關(guān)激素水平較NC組小鼠高且2組體重增加量具有顯著差異。這一結(jié)果說明了CRS組小鼠受到應激后HPA軸被激活，產(chǎn)生了一系列全身性變化，導致小鼠基本指標的改變。

GERD的表現(xiàn)則集中在食管黏膜炎癥反應及病理表現(xiàn)上，評判的標準也多源于GERD相關(guān)研究，包括對組織的評估如：潰瘍、糜爛、充血、水腫、基底細胞厚度、固有層乳頭長度、上皮內(nèi)中性粒細胞/淋巴細胞/嗜酸性粒細胞浸潤[19]。本研究結(jié)果顯示，CRS組小鼠在慢性應激后可出現(xiàn)食管及胃組織上皮細胞增厚、黏膜層各類炎性細胞的浸潤等變化，而NC組小鼠食管、胃組織未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

綜上所述，束縛應激作為一種非損傷性刺激的實驗動物模型，能夠較好地模擬人類生活中心理應激反應狀態(tài)。雖然目前尚無統(tǒng)一標準用以評價慢性束縛應激模型的建立是否成功，但我們可以通過不同角度觀察機體病理生理變化，分析其原因能夠確認模型成功與否。除此之外，束縛應激對各大系統(tǒng)的影響已日漸明了，但其在胃食管消化系統(tǒng)尤其GERD疾病方面的作用機制還有待深入的研究。本研究的目的在于一方面為后期深入研究精神心理因素在GERD發(fā)生、發(fā)展的機制提供簡單有效并且具有借鑒意義的實驗方法；另一方面為束縛應激模型的成功建立提供參考指標，并為研究提供新的思路。