p PB修飾的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的制備研究

木尼熱·庫爾班，王 梅，由淑萍，劉 濤（新疆醫科大學公共衛生學院，新疆 烏魯木齊 830011）

肉蓯蓉（Herba Cistanches）為列當科植物管花肉蓯蓉的干燥帶鱗葉的肉質莖，具有補腎、益經血、潤腸通便等作用，有“沙漠之參”之稱[1-3]。苯乙醇總苷是肉蓯蓉的主要化學成分之一，主要包含松果菊苷與毛蕊花糖苷兩種成分。研究顯示苯乙醇總苷能夠明顯抑制機體內酪氨酸酶的活性，并在修復自由基損傷、抗衰老、抗疲勞、抗色素沉著、抗老年癡呆癥方面顯示了強大的功效[3-5]。

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是肝臟遭受反復或慢性損傷后的一種損傷與修復過程，主要與慢性炎癥和引起慢性肝臟損傷的化學因素相關。研究表明，肉蓯蓉苯乙醇總苷可降低肝纖維化大鼠肝組織中的膠原纖維生成，因此具有良好的抗肝纖維化的作用[6-8]。環肽pPB能特異性識別血小板源生長因子受體，因此能靶向到肝纖維化細胞。脂質體（liposomes）是由磷脂構成的雙分子層結構的微型囊泡，脂質體作為藥物載體具有緩釋、降低藥物毒性、保護被包封的藥物和靶向性等特點，以脂質體給藥后，其可將藥物自動轉運到肝、脾、肺和骨髓等組織器官，對于治療肝、脾部位疾病及提高藥物的治療指數具有很好的作用[9-11]。在上述基礎上，本研究擬將肉蓯蓉苯乙醇總苷制成pPB環肽修飾的脂質體，利用pPB環肽作用，使脂質體聚集到肝纖維化的細胞，更好地發揮肉蓯蓉苯乙醇總苷治療肝纖維化的作用。本研究采用不同的制備方法分別制備p PB修飾的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體，并選擇松果菊苷為含量測定指標，對脂質體的粒徑、電位和包封率進行測定，最終確定該脂質體的制備方法[12-13]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB135-S分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；T6新世紀紫外可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限公司）；EYELAN-2100旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；Malvern Nano-2S90型激光粒徑測定儀（英國馬爾文儀器有限公司）；JEOL-1340H透射電子顯微鏡（捷歐路科貿有限公司）；85-2型控溫磁力攪拌機（江蘇金怡儀器科技有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

松果菊苷對照品（批號327A021，含量98%，北京索萊寶科技有限公司）；苯乙醇總苷原料藥（實驗室自制，純度95%）；大豆卵磷脂（Lipoid公司）；二棕櫚磷脂酰膽堿（DPPC，意大利Corden Pharma公司，批號T0343）；膽固醇（美國Sigma公司）；馬來酰基-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（Mal-DSPE-PEG2000，美國Nanocs公司，批號130916）；p PB（Cys*-Ser-Arg-Asn-Leu-lle-Asp-Cys*，批號20170204，含量98.49%，上海吉爾生化有限公司）；N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫基乙酸酯（SATA，美國Sigma公司，批號SLBR3300V）；Sephadex G-50（100-300）（美國Sigma公司，批號SLBB6637V）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 最大吸收波長的選擇取適量甲醇溶解松果菊苷對照品，以甲醇作為空白，在紫外分光光度儀上200 ～ 400 nm范圍內進行紫外掃描，考察最大吸收波長，結果顯示在330 nm處松果菊苷有最大吸收。

2.1.2 標準曲線建立精密稱取松果菊苷對照品適量，用甲醇溶解并定容至刻度，得200 μg·mL-1的松果菊苷對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液適量，用甲醇溶解，制得濃度分別為5.0、8.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1對照品溶液，將各溶液置于330 nm處測定吸光度值，以濃度（C）對吸光度（A）值作線性回歸，得線性回歸方程C = 42.615 A + 1.210 8，r =0.999 8，結果表明，在5.0 ～ 40.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.1.3 精密度實驗配制10.0、20.0、40.0 μg·mL-1的低、中、高濃度的松果菊苷對照品溶液，每個濃度配3份，1天內重復測定3次，計算日內精密度，連續測定3 d，計算日間精密度。結果顯示日內精密度和日間精密度的RSD值均小于2%，表明方法精密度良好。

2.1.4 回收率考察取0.8 mL肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體作為樣品的加入量，并加入高、中、低濃度松果菊苷對照品溶液分別為0.5、1.0、2.0 mL，使對照品量分別為樣品加入量的120%、100%、80%，樣品與對照品溶液混合均勻后，用甲醇定容至刻度，用紫外分光光度計測定藥物含量，計算對照品的加入量及回收率。回收率（%）=（測得總量-樣品加入量）/實際對照品的加入量×100%。結果顯示松果菊苷的平均回收率分別為98.85%、100.67%、99.62%，RSD均小于2%，回收率符合規定，結果見表1。

表1 苯乙醇總苷含量加樣回收率實驗結果Tab 1 Results of recovery rates of phenylethanoid glycosides

2.2 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的制備

2.2.1 薄膜分散法制備肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體稱取卵磷脂、DPPC、膽固醇適量（質量比為2∶2∶1），溶于適量氯仿和甲醇混合溶劑中（氯仿∶甲醇 = 4∶2，v∶v），置于旋轉蒸發儀，在49 ～ 50 ℃下旋轉蒸發使成膜狀，然后加入250 μg·mL-1的苯乙醇總苷水溶液旋轉水化，即得脂質體，將所得脂質體分別用0.45 μm微孔濾膜擠壓4 ～ 5次，0.22 μm的微孔濾膜擠壓18 ～20次，即得肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體。

2.2.2 二次包封法制備肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體稱取卵磷脂、DPPC、膽固醇適量（質量比為2∶2∶1），溶于適量氯仿和甲醇混合溶劑中（氯仿∶甲醇 = 4∶2，v∶v），置于旋轉蒸發儀，在49 ～ 50 ℃下旋轉蒸發使成膜狀，然后加入250 μg·mL-1的苯乙醇總苷水溶液旋轉水化，得脂質體備用。同法再次取磷脂成分溶于氯仿，旋轉成膜狀后，將制得備用的脂質體加入，再次旋轉水化，即得二次包封的脂質體。將所得脂質體分別用0.45 μm的微孔濾膜擠壓4 ～ 5次，0.22 μm的微孔濾膜擠壓18 ～ 20次，即得肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體。

2.2.3 逆相蒸發法制備肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體稱取質量比為2∶2∶1的卵磷脂、DPPC、膽固醇，溶于適量氯仿和甲醇混合溶劑中（氯仿∶甲醇 = 4∶2，v∶v），加入250 μg·mL-1苯乙醇總苷原料藥水溶液適量，冰浴超聲1 h，直至形成穩定的乳劑，采用旋轉蒸發儀減壓蒸發，達到膠態后，加適量水水化，繼續減壓蒸發除去殘留溶劑，將所得脂質體分別用0.45 μm的微孔濾膜擠壓4 ～ 5次，0.22 μm的微孔濾膜擠壓18 ～20次，即得肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體。

2.2.4 pPB-DSPE-PEG2000的制備首先將環肽pPB分子中引入巰基（-SH），然后使p PB環肽上巰基與Mal-DSPE-PEG2000末端的馬來酰基發生C-S加成反應。具體方法為：將4 mg pPB溶于PBS緩沖液，并與8 mg SATA混合，使SATA與pPB質量比為2 : 1,在室溫下攪拌2 h后，加入Mal-DSPE-PEG2000，室溫下磁力攪拌24 h，將所得反應產物用截留分子量為3500Da的透析袋透析除去多肽、SATA等，截留下鏈接好的產物p PB-DSPE-PEG2000，將產物冷凍干燥后備用。為檢測偶聯是否成功，將p PB-PEG2000-DSPE和Mal-PEG2000-DSPE分別溶于氚代氯仿中，分別測定1H-NMR，通過比較馬來酰基特征峰（6.7 ppm）的消失與否來驗證偶聯是否成功。結果表明pPB-PEG2000-DSPE1H-NMR圖譜中6.7 ppm未見相應的馬來酰基峰出現，說明偶聯已成功。

2.2.5 pPB修飾的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的制備稱取大豆磷脂、DPPC、膽固醇、pPB-DSPE-PEG2000（質量比為10 : 10 : 5 : 1）溶于氯仿和甲醇的混合溶劑，同“2.2.2”項下方法制備pPB修飾的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體。

2.3 苯乙醇總苷脂質體的體外性質考察

2.3.1 不同方法制得的脂質體的粒徑、電位測定采用Malvern粒徑測定儀測定脂質體的粒徑和電位，結果見表2，由結果可知，3種方法形成的脂質體粒徑均在200 nm左右，粒徑均勻，電位均在35 ～ 45 mV。

2.3.2 脂質體的包封率測定1）洗脫曲線測定：采用葡聚糖凝膠柱洗脫法測定脂質體的包封率，取SephadexG-50裝柱，使徑高比為1∶10（cm∶cm），取1 mL脂質體上樣，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液洗脫，流速控制在1 mL·min-1，每2 mL接取一個流份，共接取30個流份，所得流份分別用2 mL甲醇溶解，置于330 nm處測定吸收度，以流份為橫坐標，以藥物濃度為縱坐標，繪制洗脫曲線。結果表明，脂質體流份在第3 ～ 6流份流出，游離藥物在7 ～ 14流份流出。

表2 不同方法制得的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的粒徑. n = 3Tab 2 Particle size of the phenylethanoid glycosides liposomes prepared by different methods. n = 3

2）不同制備方法制得的脂質體包封率的測定：包封率測定方法為：取SephadexG-50（粒徑100 ～ 300 μm）裝柱，使徑高比為1 cm∶10 cm，取不同制備方法制得的脂質體1 mL分別上樣，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，流速控制在1 mL·min-1，收集脂質體流份，從中取2 mL加甲醇破乳溶解后測定松果菊苷的含量，作為脂質體中包封的藥物含量。另取苯乙醇總苷脂質體1 mL直接加甲醇破乳溶解后，測定松果菊苷的含量作為脂質體中藥物總量。按下述公式計算包封率：包封率%=（脂質體中包封藥物量/脂質體中藥物總量）×100%。

本研究結果表明，采用薄膜分散法、二次包封法、逆相蒸發法制得脂質體的載藥量分別為（28.55 ±5.61）%，（38.46 ± 7.85）%，（33.88 ± 3.50）%。用SPSS 16.0軟件中SNK-Q檢驗對三種方法制備的肉蓯蓉總苷脂質體包封率均數兩兩比較，以P ＜ 0.05為差異具有統計學意義。結果顯示，二次包封法制得的脂質體的包封率最高。

2.3.3 脂質體的載藥量測定取制得的脂質體1 mL精確稱重，記錄載藥脂質體的總重量，將此1 mL脂質體同“2.3.2”項下方法上樣洗脫后，測得脂質體中的載藥量，依據公式：載藥量=Wd/WL×100%，其中Wd表示包封于脂質體中的藥量，WL表示載藥脂質體的總重量。

結果顯示采用薄膜分散法、二次包封法、逆相蒸發法制得脂質體的載藥量分別為（2.73±0.57）%，（3.71±0.32）%，（3.28±0.49）%。

2.3.4 pPB修飾的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的體外性質測定1）pPB修飾的苯乙醇總苷脂質體的粒徑、電位、包封率、載藥量的測定：對不同制備方法所得的脂質體的粒徑、電位、包封率和載藥量的結果進行比較，結果表明，二次包封法制得的脂質體的包封率和載藥量最高，粒徑和電位與其它制備方法相似，因此確定二次包封法是制備脂質體的最優方法。在此基礎上，采用二次包封法制備了pPB修飾的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體，其粒徑為（227.60±1.63）nm、電位為（- 45.37±1.62） mV、包封率為（35.55±7.35）%、載藥量為（3.80±0.28）%。

2）脂質體形態觀察：取二次包封法制得的p PB修飾的苯乙醇總苷脂質體混懸液1滴，滴至專用銅網上，用磷鎢酸染色后，自然晾干，于透射電鏡下觀察脂質體形態，結果見圖1。

圖1 p PB修飾的苯乙醇總苷脂質體的透射電鏡圖Fig 1 TEM photo of pPB-modified phenylethanoid glycosides liposomes

3 討論

脂質體是磷脂雙分子層構成的囊泡，無毒副作用和免疫原性，用其包封藥物后，具有使藥物生物利用度提高，增加藥物靶向性，降低藥物毒性等優點。同時在脂質體表面偶聯能與靶點高效結合的配體（如pPB環肽）后，可使脂質體與靶細胞表面相應的受體分子特異性結合，從而將藥物靶向至具有特異性受體的細胞、組織或器官。

通過HPLC方法測定，發現肉蓯蓉總苷主要成分為松果菊苷和毛蕊花糖苷，這兩種成分在HPLC條件下能夠同時出峰，其中松果菊苷含量更高，同時根據文獻報道，肉蓯蓉總苷可選用松果菊苷作為指標性成分，因此本研究選用松果菊苷作為測定肉蓯蓉總苷的指標性成分。有文獻報道，除HPLC方法外，由于松果菊苷在總成分中占比較高，因此為了便于測定，本文在采用UV法測定肉蓯蓉苯乙醇總苷含量時，以測定松果菊苷含量為主要指標[14]。

凝膠柱層析法是利用分子篩的原理，通過在凝膠柱上滯留時間的差別對傳遞體和游離藥物進行分離，脂質體的分子大，滯留時間短，洗脫較快；游離藥物分子小，滯留時間長，洗脫較慢，從而使脂質體與游離藥物得到較好的分離。選擇適當的有機溶劑和油水比可制備較穩定的脂質體，本研究過程中發現氯仿和甲醇混合溶劑為有機溶劑，比單獨使用一種溶劑更容易形成穩定的脂質體。

本實驗測得的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的包封率較低，可能與該藥物本身的性質有直接的關系。當藥物油水分布系數（logP）＜ - 0.3或＞ 4.5時，藥物可被包封成具有較高包封率的脂質體，否則包封率較低。肉蓯蓉苯乙醇總苷的logP約為1，介于兩者之間，這可能是導致脂質體包封率較低的主要因素[15]。