2012—2016年上海地區AIDS患者分枝桿菌分離及耐藥情況分析

蔡金鳳， 張桂紅， 鄭江花

（1. 上海市公共衛生臨床中心醫學檢驗科，上海 201508；2. 上海健康醫學院附屬周浦醫院檢驗科，上海 201318）

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的慢性傳染病，主要通過血液和性行為傳播。HIV攻擊人體免疫細胞，引起機體免疫力下降，從而繼發各種機會性感染，是AIDS患者主要死因之一[1-2]。近年來，HIV感染合并結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染已成為公共衛生系統的重大問題。分離自AIDS患者的大量非結核分枝桿菌（nontuberculous Mycobacterium，NTM）[3]，進一步提示為AIDS患者合并分枝桿菌感染的防治提供新策略已經迫在眉睫。上海市公共衛生臨床中心為上海地區AIDS患者唯一定點收治醫院，為了解本地區AIDS患者分枝桿菌感染狀況及藥物敏感情況，本研究對上海市公共衛生臨床中心2012—2016年收治的所有AIDS患者分枝桿菌分離及耐藥情況進行分析。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2012年7月—2016年12月上海市公共衛生臨床中心收治的1 940例AIDS住院患者所有送檢分枝桿菌培養的臨床樣本，包括痰液、灌洗液、尿液、糞便、穿刺液、胸水、腹水、分泌物、引流液、支刷物、全血和腦脊液等。同一患者相同樣本類型的同一分離菌株不重復計算。

1.2 儀器與試劑

美國BD公司BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統和SIRE系列試劑盒、BACTEC9120血液培養系統及配套培養瓶；美國Sigma-Aldrich公司生產的改良中性羅氏培養基；杭州創新生物檢控技術有限公司生產的凱必利MTB抗原檢測試劑盒（膠體金法）。所有AIDS患者均經過酶聯免疫吸附試驗和免疫印跡法（western blot，WB）確診HIV抗體陽性。

1.3 方法

1.3.1 分枝桿菌分離培養 非血液樣本采用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌液體培養技術、血液樣本接種于含溶血素分枝桿菌/真菌瓶，采用BACTEC9120血液培養系統進行分枝桿菌培養。

1.3.2 分枝桿菌菌型鑒定 采用MTB抗原檢測試劑盒（膠體金法）對分枝桿菌進行菌型鑒定，區分MTB和NTM。

（1）固體培養基培養物處理方法。用培養抗酸菌的固體培養基（如改良羅氏培養基）37°C培養2～4周，直至培養基上能確認菌落生長為止。步驟為：在試管中加入0.2 mL生理鹽水，從培養基上生長的菌落中采集菌體1 μL，將采集的菌體懸混在試管內的緩沖液中，試管加蓋后用渦旋混合器充分攪拌，將懸濁的菌液作為樣本待測。

（2）液體培養基培養物處理方法。用培養抗酸菌的液體培養基37°C培養1～2周，直至能確認菌落生長、培養液渾濁為止。攪拌培養容器內的培養液，將其作為樣本待測。

（3）分枝桿菌菌型鑒定。將100 μL樣本滴到檢測板，15 min后觀察，判定方法為：檢測線（T）及質控線（C）均出現紫紅色條帶判定為MTB，僅質控線（C）出現紫紅色條帶判定為NTM。

1.3.3 分枝桿菌藥物敏感性分析 采用《中國結核病防治規劃實施工作指南（2008）》[4]推薦的比例法進行藥物敏感性試驗，以改良中性羅氏培養基作為基礎培養基，按照《結核菌檢驗細菌學檢驗規程》[5]的要求進行操作。采用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統檢測分枝桿菌對一線抗結核藥物的敏感性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 分枝桿菌分離情況

2012—2016年共送檢1 940例AIDS住院患者的分枝桿菌培養樣本4 648例，人均送檢樣本2.4例，其中分枝桿菌陽性樣本892例（19.19%）；1 940例AIDS患者中分枝桿菌感染者420例（21.65%）。分枝桿菌年度分布見表1。

2.2 不同類型樣本分枝桿菌分離情況

送檢樣本中以痰液及腦脊液樣本居多，二者的分枝桿菌分離率分別為20.08%和6.98%；而全血樣本5年內僅送檢了37例，有31例分離出分枝桿菌。

2.3 MTB和NTM樣本分布情況

通過MTB抗原檢測試劑盒（膠體金法）對陽性樣本中的分枝桿菌進行菌型鑒定，共鑒定出409株不重復菌株，其中MTB 199株（48.66%）、NTM 210株（51.34%）。MTB和NTM樣本來源均以痰液為主，分別占58.29%和71.43%；MTB樣本來源居第2位的為腦脊液，共19例（9.55%）；而以腦脊液為樣本來源的NTM則僅有3例（1.43%）。NTM除分離自痰液外，主要分離自全血和糞便樣本，分別為16例（7.62%）和15例（7.14%）。見表3。

表1 2012—2016年各年AIDS住院患者分枝桿菌檢出情況

表2 不同類型樣本分枝桿菌分離情況

2.4 MTB藥物敏感性試驗結果

對128株MTB進行一線抗結核藥物的耐藥分析。MTB對利福平、鏈霉素、乙胺丁醇和異煙肼的耐藥率分別為18.75%、28.13%、15.63%和32.03%。根據2013年世界衛生組織對耐多藥結核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDRTB）的定義——結核病患者感染的MTB藥物敏感性試驗證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥，確定128株MTB菌株中，耐多藥結核分枝桿菌共23株，MDR-TB耐藥率為17.97%。

表3 MTB和NTM的本本分布情況

表4 128株MTB藥物敏感性試驗結果

3 討論

NTM是指MTB及麻風分枝桿菌以外的所有分枝桿菌。隨著人們對NTM認識的深入以及分枝桿菌菌型鑒定技術的發展，NTM的檢出率也越來越高。NTM廣泛存在于自然環境中，包括土壤和水，為條件致病菌，目前尚無NTM在人與人之間相互傳播的證據。人類感染的NTM主要來源于生活環境，其中肺部NTM感染的病例較多[6]。對于AIDS等免疫缺陷患者，NTM的分離率也較高。近年來，NTM在AIDS患者中的感染上升趨勢明顯，成為AIDS合并機會性感染的重要病原體之一[7]。

目前，龜-膿腫分枝桿菌復合群和鳥-胞內分枝桿菌復合群為人類主要NTM致病性菌種[8-10]。NTM感染患者常無明顯臨床癥狀，而肺部感染患者常表現出與MTB感染相似的癥狀，臨床難以區分[8]。由于NTM與MTB感染在致病機制和防治策略上存在差異，準確區分MTB和NTM感染很有必要。現行的分枝桿菌菌種鑒定試驗主要有傳統的對硝基苯甲酸（p nitro benzoicacid，PNB）/噻吩-2-羧酸酰肼（2-thiophenecarborylicacid hydrazide，TCH）改良羅氏法、免疫膠體金法或熒光探針聚合酶鏈反應，傳統的PNB/TCH改良羅氏法將分枝桿菌初步分為結核復合群、牛結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，但耗時較長，需要28 h才能報告結果；熒光探針聚合酶鏈反應雖然僅3 h即可報告結果，但需特殊儀器，對實驗室環境和技術人員要求高，在大部分基層實驗室難以推廣。相比較而言，膠體金法各項分析指標（敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值）均高于PNB/TCH改良羅氏法，且檢測所需時間僅為15 min，與熒光探針聚合酶鏈反應（3 d）和傳統法（28 d）比較，具有明顯優勢。因此，培養法結合基于MPB64的膠體金法對分枝桿菌的鑒定具有快速、經濟、操作方便、無須大型儀器投入的優點，有望在結核病診斷中被廣泛應用，是對現有結核病細菌學檢測手段的有益補充。

上海地區NTM感染情況目前尚未見文獻報道，胡忠義等[11]對上海地區1987—1996年分離自患者肺部的5 619株分枝桿菌做菌型鑒定時發現，2.3%的分枝桿菌為NTM。本研究通過分析1 940例AIDS住院患者分枝桿菌感染及NTM分離情況來推測NTM在AIDS等免疫缺陷患者中的流行狀況。從分枝桿菌分離情況來看，1 940例AIDS患者中有420例患者分枝桿菌培養陽性，陽性率達21.65%；共送檢患者樣本4 648例，陽性樣本892例，陽性檢出率為19.19%；共分離出不重復菌株409株，包含199株MTB（48.66%）和210株NTM（51.34%）。分枝桿菌分離鑒定結果提示上海地區AIDS患者中NTM感染比例較大，感染情況較MTB感染更為嚴重。樣本來源分布顯示，MTB和NTM主要分布在痰液樣本中。2012年，MCCARTHY等[3]對東南亞地區AIDS患者的NTM感染情況進行分析時發現，來自越南、泰國和柬埔寨的AIDS患者中，有13%的患者合并MTB感染，11%的患者合并NTM感染；而泰國與越南AIDS患者NTM占分枝桿菌培養陽性樣本的64%，與上海地區AIDS患者NTM感染情況一致；并且他們發現高效抗逆轉錄病毒治療能夠降低AIDS患者的NTM感染率。

藥物敏感性試驗結果顯示，從AIDS患者中分離的MTB對鏈霉素和異煙肼的耐藥率均較利福平和乙胺丁醇高，且多重耐藥率增高，達到17.97%。因未常規開展NTM藥物敏感性試驗，且未對NTM進行菌株的鑒定是本研究的不足。2017年《非結核分枝桿菌肺病治理指南》[12]提出，不同的NTM在治療前需進行的藥物敏感性試驗所需藥物不同，如需操作和報告藥物敏感性試驗結果應遵循美國臨床實驗室標準化協會的要求進行藥物敏感性試驗。同時，單純的敏感或耐藥已不能滿足臨床需求，最低抑菌濃度和臨界濃度更有指導意義。但本研究的回顧分析結果表明，上海地區AIDS患者NTM陽性分離率很高，有效的預防NTM感染的措施應成為NTM感染研究的主要方向之一。

綜上所述，上海地區AIDS患者NTM感染嚴重，及早對HIV感染合并NTM感染患者進行診斷，有利于早期防治NTM感染，最大程度地減少NTM感染給患者帶來的危害。