牙周炎患者病原菌感染狀況及RANKL/OPG變化

劉勇剛， 施立煌， 張子楊， 賈 忠

（1.浙江理工大學校醫院口腔科，浙江 杭州 310018；2.杭州市大江東醫院檢驗科，浙江 杭州 311225；3.杭州植得口腔門診部口腔科，浙江 杭州 310003；4.杭州市第一人民醫院普外科，浙江 杭州 310006）

牙周炎是一種常見的慢性口腔炎癥，其特征是牙周組織受損，牙周附著被破壞，易造成根面牙骨質的病理性改變，表現為牙周袋和牙齒松動或缺失，嚴重影響患者的生活質量[1]。牙周炎通常因口腔病原菌感染而被引發，核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）系統是骨代謝的信號通路，病原菌及炎癥因子通過調節RANKL/OPG，使其比例失調，導致牙槽骨吸收[2-3]。為了探討牙周炎患者病原菌感染狀況及RANKL/OPG變化，為牙周炎的臨床預防與治療提供理論依據和針對性指導，我們對接受治療的牙周炎患者進行了研究。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2015年6月—2017年6月在浙江理工大學校醫院接受口腔科治療的130例牙周炎患者作為觀察組，其中男71例、女59例，年齡（41.80±7.66）歲。納入標準：（1）牙齦溝液培養陽性，臨床表現為牙齦疼痛、紅腫，探診牙齦出血、牙周溢膿或松動，牙槽骨吸收等癥狀；（2）經X線檢查確診牙周炎。排除標準：（1）有牙周疾病治療史者；（2）合并高血壓、心臟病者；（3）哺乳和妊娠期婦女。另選取同期同院體檢健康者50名作為對照組，其中男26例，女24例，年齡（42.71±9.05）歲。2組性別、年齡等一般資料差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究在杭州市第一人民醫院倫理委員會的許可下開展，所有研究對象知情同意。

1.2 方法

選取每位患者2顆牙，采用探針測量2組受檢者的牙周探診深度（probing depth，PD）、附著喪失（attachment loss，AL）、菌斑指數（plaque index，PLI）和齦溝出血指數（sulcus bleeding index，SBI）等指標。PD 為牙周袋底部到牙齦緣的距離，AL為探針深度減去釉牙骨質界與齦緣之間的距離。PLI采用Loe和Silness菌斑指數分度法計分，按照菌斑程度計為0、1、2、4分（無出血計1分，齦溝輕度出血計2分，牙齦發紅但未見紅腫計3分，牙齦潰爛計4分）。

采用濾紙條法收集齦溝液。在牙周探診最深位點處收集齦溝液樣本。收集部位隔濕，去除齦上牙石，溫空氣輕吹10 s，用濾紙條輕輕插入齦袋，30 s后取出濾紙條，10 s后在同一部位再次取樣。重復取樣3次后稱重，將重量差按1 mg/μL的比例換算成體積。樣本于-70 ℃冷凍保存。

取出樣本，置室溫搖床中解凍，4 ℃??5 000×g離心5 min，去除濾紙條。采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測齦溝液中病原菌分布的情況，首先應用微量樣品基因組提取試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）提取齦溝液中的DNA，-20 ℃保存，所檢測菌種的 16sRNA引物由南京森貝伽生物科技有限公司提供，建立實時熒光定量PCR反應體系，對PCR擴增的熔解曲線進行測序，以同源性 ≥99%為標準判定目標菌。采用酶聯免疫吸附試驗試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）測定上清液 RANKL和OPG水平，嚴格按照產品說明書進行操作。

1.3 觀察指標

（1）比較2個組受檢牙的PD、AL、PLI和SBI。（2）統計觀察組患者的病原菌分布。（3）比較2個組的齦溝液RANKL、OPG及RANKL/OPG。（4）統計觀察組的臨床檢查結果（PD、AL、PLI和SBI）與RANKL、OPG的相關性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料以x ±s表示，2個組間比較采用t檢驗；計數資料以[例（%）]表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床檢查結果

觀察組受檢牙的 PD、AL、PLI和SBI顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 觀察組和對照組的PD、AL、PLI和SBI比較 （x±s）

2.2 觀察組與對照組病原菌分布

觀察組共檢出病原菌171株，對照組共檢出病原菌19株。觀察組的齦卟啉單胞菌、伴放線放線菌和生痰二氧化碳嗜纖維菌的檢出率較高，均超過20%，牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線菌、生痰二氧化碳嗜纖維菌和齒蝕擬桿菌的檢出率明顯高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 觀察組與對照組病原菌分布

2.3 觀察組與對照組RANKL和OPG水平的比較

觀察組齦溝液中的RANKL水平高于對照組，OPG水平低于對照組，RANKL/OPG也高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 觀察組和對照組RANKL、OPG水平及RANKL/OPG的比較 （x±s）

2.4 臨床檢查結果與RANKL、OPG水平的相關性

牙周炎患者的OPG水平與PD和AL存在負相關關系（P＜0.05），RANKL水平、RANKL/OPG/與PD和AL無相關性（P＞0.05），RANKL水平、OPG水平及RANKL/OPG與PLI和SBI均無相關性（P＞0.05）。見表4。

表4 RANKL、OPG和RANKL/OPG與PD、AL、PLI、SBI的相關系數

3 討論

牙周炎主要表現為牙齦炎癥、牙周組織受損、牙槽骨吸收，牙齒根基動搖，與身體其他部位的健康密切相關[4]。牙周炎通常因口腔內病原菌感染所致，牙周病患者因牙周組織受到破壞、上皮根遷移，使其暴露于口腔，而牙根表面的菌斑及細菌等滲入牙本質中，引發牙周炎[5-6]。研究牙周炎病原菌感染狀況及RANKL/OPG變化，有利于指導牙周炎的預防和治療[7]。

本研究結果顯示，牙周炎患者受檢牙的PD、AL、PLI和SBI均顯著高于體檢健康者，結果符合患者的臨床癥狀。牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線菌、生痰二氧化碳嗜纖維菌等是牙周炎的主要致病菌。有研究結果表明，伴放線放線菌是局限型侵襲性牙周炎的主要病原菌，牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎病變區或活動部位最主要的優勢菌，其存在與牙周炎治療后復發或病情加重密切相關，重度牙周炎患者齦下菌斑的福賽坦氏菌檢出率較高[8-10]，與本研究結果基本一致。患者感染病原菌的原因可能是口腔衛生條件較差、刷牙習慣不健康、吸煙、合并其他基礎性疾病等[11]。

RANKL和OPG是牙周炎牙槽骨吸收的重要調節因子，其比值可以作為評價牙槽骨吸收程度的指標[12-13]。正常狀態下，RANKL的表達弱于OPG，破骨細胞生成較少，牙周內環境相對穩定，而牙周炎患者的成骨細胞內RANKL的表達明顯增高，牙周局部微環境RANKL和OPG的平衡失調，破骨活動活躍，促進破骨細胞形成引起的骨質吸收，牙槽骨發生過量吸收，影響其骨密度和骨強度[14-15]。本研究結果也顯示，牙周炎患者齦溝液中RANKL水平顯著高于體檢健康者，OPG水平明顯低于體檢健康者，RANKL/OPG高于體檢健康者。

此外，本研究結果還顯示，OPG水平與PD和AL存在負相關關系，RANKL、OPG及RANKL/OPG與患者的PLI和SBI之間無相關關系，說明患病程度與牙槽骨的吸收沒有必然的因果關系，糾正RANKL和OPG之間的失衡，可能為慢性牙周炎的治療提供新的思路。

綜上所述，牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線菌、生痰二氧化碳嗜纖維菌等病原菌是牙周炎的主要致病菌，RANKL和OPG在牙周炎患者牙槽骨組織被破壞的過程中發揮作用。