羅氏沼蝦病毒病檢測和免疫防治進展

翁宏飚，沈衛鋒，牛寶龍

(浙江省農業科學院 a. 蠶桑研究所，b. 水產研究中心，浙江 杭州 310021)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)屬長臂蝦科沼蝦屬，又稱馬來西亞大蝦、白腳蝦、金線蝦、淡水長臂蝦等，主要生活于淡水或咸淡水水域中，具有生長快、食性廣、肉質營養成分好、養殖周期短等優點，有“淡水蝦王”之稱，經濟價值高，是世界性大型淡水蝦養殖品種。羅氏沼蝦于1976年從日本引進我國，是目前我國重要的水產經濟蝦類。相比其他養殖蝦類，羅氏沼蝦體質較為強壯，有較強的抵抗力，但是隨著養殖方式改變和養殖環境惡化，羅氏沼蝦養殖發病風險大大增加。從20世紀90年代中期開始，羅氏沼蝦養殖過程中疾病呈現暴發趨勢。根據病原不同，可將羅氏沼蝦病害分為寄生蟲病、真菌病、細菌病和病毒病。生產上主要通過養殖環境調控、藥物防治及免疫增強劑應用等方法，對羅氏沼蝦的寄生蟲病、真菌病和細菌病進行防控[1]，而關于羅氏沼蝦病毒病，生產上尚無有效的防治措施。近年來，國內外許多學者嘗試應用免疫技術對羅氏沼蝦白尾病進行防治，本文重點就引起該病的諾達病毒(MrNV)免疫防治研究進展做綜述，以期為今后有效防控MrNV提供參考。

1 羅氏沼蝦病毒病

目前已明確的羅氏沼蝦病毒病主要有2種。一種是通過消化道感染的細小病毒樣病毒病(HPV)[2]，鏡檢可觀察到被感染的肝胰腺上皮細胞細胞核變大，其中有嗜堿性包涵體，電鏡觀察可見直徑約29 nm的20面體病毒顆粒，病癥與昆蟲濃核病病癥相似。中國對蝦(Penaeuschinensis)的HPV探針不能與羅氏沼蝦HPV雜交，說明兩者基因組差異較大，兩種HPV沒有親緣關系，或親緣關系較遠[3]。另一種是表現為白尾癥狀的肌肉壞死病，被稱為羅氏沼蝦白尾病。該病主要在苗種期爆發，發病蝦苗在短時間內大量死亡，發病幼苗的肌肉呈白濁現象，也被通稱為羅氏沼蝦肌肉白濁病，對羅氏沼蝦生產的危害較大[4]。該病最早報道于法國瓜德羅普島，取病蝦肌肉組織的超薄切片進行電鏡觀察，可見被侵染細胞的細胞質中有0.5～3 μm的嗜堿性病毒包涵體顆粒[5]。之后，該病陸續在中國[6-7]、印度[8]、泰國[9]、印度尼西亞[10]、澳大利亞[11]等地被報道，從病蝦組織中均可同時分離到諾達病毒(MrNV)及其衛星樣病毒(XSV)[12]。感染實驗表明，MrNV是引起該病的主要病原[13]。該病主要感染對象是羅氏沼蝦幼苗，發生在蚤狀幼體發育結束后的幼蝦時期。對羅氏沼蝦成蝦攻毒后，雖然在多個組織中可以檢測到病毒，但很少會導致成蝦死亡，帶毒而不表現出癥狀的成蝦很可能是病毒水平傳播的宿主[8]。多種水生昆蟲可攜帶MrNV病毒，可能在病毒傳播中起作用[14]。病毒還可以感染不同發育階段的鹵蟲，因此鹵蟲也是病毒傳播過程的中間宿主[15]。病毒除水平傳播外，在帶毒親蝦的卵巢組織中也可檢測到病毒，推測該病還可通過垂直傳播途徑傳播[8]。MrNV可以通過電壓門控鈣離子(CAV)介導的細胞內吞途徑侵染昆蟲sf9培養細胞[16]。紫外線照射5 min以上、高pH值(pH>8.5)，以及200 mg·kg-1的次氯酸鈉、福爾馬林、氯化苯甲烴銨等均可滅活病毒[17]。另外，自2009年起，在我國浙江、江蘇、廣西、廣東等地羅氏沼蝦苗種場，出現了一種幼體死亡綜合征，給生產造成一定危害。從瀕死的幼體中分離到病毒顆粒大小25～29 nm的新病毒，命名為MrTV。感染實驗證實，該病毒是幼體死亡綜合征的病原，基因組分析發現，該病毒是10 303 nt的單鏈RNA病毒，屬于二順反子病毒科Aparavius屬[18]。

2 羅氏沼蝦諾達病毒基因組及結構蛋白

MrNV是一種分節段RNA病毒，基因組為2條單鏈線性RNA，其中：RNA1長度約為3.1 kb，編碼一個約110 ku的RNA聚合酶；RNA2約1.4 kb，編碼42 ku的外殼蛋白。RNA1和RNA2均無poly(A)尾巴，且均已完成核酸序列測定，并在GenBank登錄(登錄號分別為AY222839、AY222840)。在病毒侵染細胞的細胞質中，還可以分離到一條約400 nt的亞基因組單鏈RNA3，其序列與RNA1的3’端一致，可編碼非結構蛋白B2，B2蛋白具有抑制RNA干涉的作用[19]。在病毒粒子成熟裝配時，RNA3不被裝入病毒粒子中。從序列同源性分析，MrNV的病毒分類地位既不屬于α-諾達病毒屬，也不同于β-諾達病毒屬，是一類新的諾達病毒成員[4]。XSV基因組為一條約900 nt的線性RNA鏈，XSV基因組不含編碼RNA聚合酶的序列[20]。

MrNV及其衛星病毒XSV病毒粒子的蛋白組成較為簡單。MrNV結構蛋白為43 ku(CP43)的單一蛋白，在肽鏈的20～29位殘基中，80%的氨基酸殘基帶正電荷，是RNA結合域，如果以Ala殘基替代這些帶正電荷的氨基酸殘基，則肽鏈失去RNA結合能力。同時，該區域與病毒組裝無關，缺失RNA結合域的突變體仍能組裝成病毒樣顆粒[21]。XSV病毒顆粒含2條分別為16 ku(CP16)和17 ku(CP17)的多肽鏈，由同一個閱讀框編碼，CP16從第2個AUG起始密碼子開始翻譯，因此CP16為CP17的N端截短肽，而非CP17的酶解產物，兩者按1∶1比例組成病毒外殼。缺失實驗證明，肽鏈的C端序列是病毒外殼組裝所必需的[22-23]。

3 羅氏沼蝦白尾病病原的檢測技術

羅氏沼蝦病毒病在生產上目前尚無有效的防治方法，主要把加強病原監控、切斷病原傳播途徑作為羅氏沼蝦病毒病預防的首要手段[24]。對于羅氏沼蝦諾達病毒，現已建立不同檢測方法，如電鏡檢查、病毒核酸電泳、夾心Elisa法等，此外，還建立了點雜交[7]、原位雜交、膠體金試紙條法、環介導反轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)[25]及雙重反轉錄(RT)-PCR技術[24]等病毒檢測技術。各種方法各有優缺點：膠體金試紙條檢測法速度快捷，操作方便，但靈敏度較低；RT-PCR靈敏度高，但耗時較長，操作煩瑣；RT-LAMP兼具快捷和靈敏度高的優點，生產上應用較廣。

4 羅氏沼蝦白尾病的免疫學防治

蝦類是無脊椎動物，關于其抵抗外界病原體的免疫機制存在爭議。長期以來，學者們認為無脊椎動物不存在后天適應形成的專一性免疫能力，一般認為，包括蝦類在內的甲殼類動物應對病原體入侵的先天免疫系統包括體液免疫和細胞免疫[26]。在對蝦抗白斑病的研究中，有多篇文獻報道以外源表達的對蝦白斑病病毒(WSSV)囊膜蛋白或核衣殼蛋白攻毒處理，可提高對蝦抗WSSV的能力[27-31]，說明對蝦在自然或實驗條件下感染病毒后，可誘導類免疫反應。研究發現，以MrNV、XSV病毒分離混合液浸漬攻毒羅氏沼蝦蝦苗，可引起蝦苗全部死亡，而浸漬攻毒或肌肉注射攻毒健康成蝦，不會引起成蝦死亡，且25 d后體內病毒即可被清除。成蝦的許多免疫指標，如酚氧化酶原(proPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、總血細胞數(THC)、超氧化物陰離子、凝血時間、氧合血藍蛋白等，攻毒處理后，在前期與對照相比發生顯著差異，而后期則差異不顯著[32]。另外，研究還發現，羅氏沼蝦成蝦對WSSV也有良好的抗性[33-34]，而幼蝦則對WSSV敏感[35]，說明羅氏沼蝦成蝦具有更有效的防御反應。印度學者將外源表達的MrNV外殼蛋白浸漬處理蝦苗24 h，或肌肉注射成蝦，再用MrNV和XSV攻毒后，檢測成蝦免疫相關指標或蝦苗免疫相關基因的表達情況，發現外殼蛋白處理可以誘導成蝦多個免疫指標，如proPO、SOD及超氧陰離子(SOA)活性顯著上升，蝦苗免疫相關基因表達上調，處理組蝦苗成活率大大提高[35]，說明羅氏沼蝦的防御系統也可以被病毒粒子或病毒外殼蛋白誘導，發生類免疫反應。

MrNV病毒基因組RNA1編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)。除參與病毒復制、調節病毒在宿主細胞中發育外，RdRp還是保持病毒穩定的靶蛋白，在外殼蛋白和其他亞單位RNA分子的合成中起作用，是病毒復制的關鍵蛋白。重組RdRp蛋白可以作為免疫誘導因子，刺激機體產生中和RdRp蛋白的免疫因子，抑制后代病毒RNA的合成[36]。肌肉注射重組RdRp可顯著提高血細胞數，誘導免疫相關基因表達顯著上調。注射重組RdRp并攻毒處理14 d后，病毒檢測呈陰性，而對照組病毒檢測呈陽性，說明外源RdRp處理后可以減少并逐步清除體內的病毒[37]。

RNA干擾是一種在進化過程中高度保守、由雙鏈RNA誘發、造成同源mRNA特異性降解的現象，被證明是一種有效的防治對蝦病毒病的方法[38]。利用細菌轉錄合成靶向MrNV外殼蛋白基因、B2基因，以及XSV外殼蛋白基因的雙鏈RNA(dsRNA)，滅活細菌后，將滅活細菌包被到羅氏沼蝦飼料上，通過口服的方式，添食單基因靶向或組合多基因靶向的dsRNA，添食24和72 h后，調查攻毒蝦苗死亡率。結果顯示，靶向病毒外殼蛋白基因的處理組存活率最高，而對照組蝦苗全部死亡。說明RNA干擾機制在羅氏沼蝦中可以工作，口服方式可以經濟、有效地將dsRNA導入羅氏沼蝦細胞并發揮作用[39]。

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關的真核表達質粒DNA(有時也可是RNA)，它可經一定途徑進入宿主體內，被宿主細胞攝取后轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機體產生非特異性和特異性2種免疫應答反應，從而起到免疫保護作用。DNA疫苗是防治對蝦WSSV過程中很有效的一種疫苗，疫苗導入對蝦后可引發有效的免疫保護反應[40]。用殼聚糖微粒包被含XSV反義基因的質粒，以口服或浸漬方法將質粒DNA導入羅氏沼蝦體內，可有效提高染毒個體的存活率，顯示DNA疫苗對羅氏沼蝦病毒病有防效。通過分析包被微粒大小、微粒運載能力及體內質粒DNA的持續時間等指標，認為口服比浸漬處理能更有效地將質粒DNA導入宿主細胞[41]。

5 羅氏沼蝦諾達病毒外殼蛋白用于制備病毒樣微粒的應用

病毒樣顆粒(virus-like particles, VLP)是含有某種病毒一個或多個結構蛋白的空心顆粒。因VLP不含有病毒核酸物質，不能自主復制，因此也不具有感染性，又因其具有真病毒的衣殼空間構象，所以VLP又被稱為“假病毒”或“偽病毒”，具有良好的生物安全性[42]。通過基因工程的方法，可對VLP的表面或內腔進行改造優化，使之具備更好的生物兼容性、更優的穩定性、更高的細胞攝入性，可用于藥物的包被和高效運輸[43]。研究發現，大腸埃希菌融合表達的MrNV外殼蛋白肽鏈，可在細菌細胞中自組裝成與病毒顆粒結構相似的20面體[44]，同時，肽鏈N端富含堿性氨基酸殘基區域易與帶負電荷核酸結合，從而在組裝過程中可將細菌核酸包裹進VLP微粒。在乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)和二硫蘇糖醇(DTT)存在的條件下，MrNV VLP微粒結構發生解開；而在CaCl2存在時，肽鏈又可重新組裝成微粒[45]。另外，雖然在肽鏈一級序列中有多個蛋白酶水解位點，但VLP微粒能在強水解條件下保持穩定，推測是肽鏈組裝成微粒后的四元結構可保護潛在的水解位點免于水解蛋白酶的作用[45]。MrNV VLP的這些特性，使之十分適合作為生物膠囊，用于外源藥物分子的包被與體內運輸。

6 羅氏沼蝦健康養殖策略

白尾病嚴重危害了羅氏沼蝦養殖業的健康快速發展，在積極研制各種抗病藥物的同時，設計羅氏沼蝦健康養殖策略，開展養殖綜合管理也極為重要[46]。

6.1 優質種苗培育

優質種苗是羅氏沼蝦健康生產的基礎，無病毒親蝦選育是優質種苗生產的關鍵。羅氏沼蝦白尾病病原的流行病學調查表明，其主要的傳播途徑是親蝦攜帶和傳播。通過對培育親蝦苗種定期進行病原檢測，養殖全過程采取嚴格的消毒、隔離措施，制定嚴格的育苗區管理制度等措施，可以確保所選親蝦健康無病毒。另外，應在苗種繁育全過程中加強親蝦營養，在投喂飼料中添加復合維生素、免疫多糖等物質，提高親蝦的體質和免疫力。此外，在羅氏沼蝦幼體階段確保適宜的環境條件也是種苗培育中須加關注的[47]。

6.2 改善養殖環境

羅氏沼蝦的生長與養殖環境密切相關。建議在放苗前對養殖塘和養殖用水做消毒處理，應用生物肥料、專用肥料和生物制劑培育良好水質[48]，根據當地氣候條件合理安排放養時間，協調養殖面積，維持合理養殖密度，以保障良好的養殖結果[49-50]。確保羅氏沼蝦養殖水質優良，是實現羅氏沼蝦健康安全養殖的前提。