細胞示蹤技術研究概述

周陳清 黃 浩

(福建師范大學生命科學學院 福州 350117)

多細胞生物正常生命活動的維持和發展建立在體內各種器官組織中各自包含的種類繁多、數量龐大的細胞之間協調活動的基礎上，細胞自胚胎發育開始就不斷地遷移和分化，在生命個體活動中扮演著各自重要的角色。示蹤各種組織細胞的活動，對于研究體內特定類型細胞的起源及命運、組織器官的發育過程、機體生理機制及疾病的發生和發展都至關重要。通過不同的標記物或采用不同的成像手段，研究者可以對同一實驗對象在不同時間點進行實時比較，也可以跟蹤同一目標細胞在體內的動態變化。這種方法既可減少實驗動物的數量，符合動物倫理要求，又可以使獲得的數據更加真實、生動和可靠。目前，最新細胞示蹤技術已經能實現對特定單個細胞及其所有后代細胞的分化和發育活動的追蹤和觀察(即細胞譜系示蹤)，為細胞再生研究提供了新思路。細胞示蹤技術已被廣泛應用于干細胞治療、基因功能研究、器官移植和新藥研發等領域。

細胞示蹤技術最早起源于20世紀初。早在1905年，Conklin等利用柄海鞘胚胎早期分裂球著色差異，對分裂球的發育過程進行觀察，提出了“胞質決定子”的理論。Mio和Maeda等使用慢速攝影技術實現對活體胚胎的示蹤觀察。此后，科學家嘗試使用多種類型的標記物，通過物理的方式注入到細胞內對其進行標記追蹤，并采用多種成像手段進行觀察記錄。本文就目前主流的細胞示蹤技術使用的標記物、標記方式和成像技術三方面的研究進展進行概述。

1 細胞示蹤標記物

理想的細胞示蹤標記物需滿足三個要求： ①標記物能明確標記初始時間點的細胞；②標記物僅保留在原始細胞及其后代中，不會擴散到鄰近的細胞中；③標記物足夠穩定，在細胞示蹤期間對細胞無毒[1]。根據標記物的種類可以分為外源性標記物和內源性標記物。

1.1 外源性標記物 外源性標記的實現比較容易，其主要方法是將標記物通過與細胞膜的吸附、擴散、內吞以及轉運等方式，按標準流程簡單孵化而導入細胞內。常見的外源性標記成像方式有： ①熒光染料成像。由于熒光染料種類很多，且都是親脂性的，故能吸附在細胞膜上，使標記細胞產生熒光而被檢測到。但是，這種方法容易受到自發熒光的干擾，而且容易淬滅，背景信號較多，信噪比較差。②量子點成像。量子點標記物一般是直徑在2～100 nm的、接近圓球形的半導體粒子，具有熒光光譜窄、不易漂移、激發光譜寬、顏色可調、光化學穩定性高以及不易分解等優點。其發光強度是有機熒光染料的20倍，穩定性是熒光染料的100倍，不易被代謝，組織存留時間較長。量子點標記物已經成為活體細胞示蹤的良好材料，有較好的發展前景。

1.2 內源性標記物 與外源性標記物相比，內源性標記物通常是具有生物活性的蛋白質，可代謝、無毒、可透過各種屏障。因其基因片段較小，容易整合到大多數細胞基因組中，對宿主細胞的正常結構和功能影響不大，同時又能穩定表達和遺傳，不存在稀釋問題，有利于較長時間的細胞示蹤觀察。內源性標記物主要包括熒光素酶、熒光蛋白及β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)3類。

1.2.1 熒光素酶 常用的熒光素酶有北美螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶[2]，其熒光波長分別為540～600 nm和460～540 nm。熒光素酶基因導入細胞后，能表達熒光素酶，通過注射底物就可觀察被標記細胞的發光現象，實現細胞示蹤。由于熒光素酶催化底物發光不需要激發光，其能量來自于酶的催化反應，發光只發生在活體細胞內，且具有一定組織穿透性，可以避免激發光造成的光噪現象。但是，熒光素酶的缺點是其催化發光容易淬滅，同時底物具有免疫原性，不適用于固定的標本等。

1.2.2 熒光蛋白 熒光蛋白與熒光素酶發光方式不同，它不需要注射底物，其發光原理是較高能量的激發光能使其蛋白構象發生改變而產生熒光。目前發現有30多種不同波長的熒光蛋白，常見的有綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和黃色熒光蛋白等。熒光蛋白由于熒光信號強，便于觀察追蹤，已經廣泛應用于細胞示蹤研究中，其中最常用的是細胞毒性最小的綠色熒光蛋白。最近，利用一種重組酶系統(Cre/Loxp)構建的雙熒光mT/mG轉基因小鼠[3]，因其能夠在Cre酶作用下改變熒光顏色，提高細胞在組織內的分辨率而引起研究者的重視。然而，熒光蛋白的局限在于熒光發光必須依賴于激發光，因此其熒光信號易受周圍組織干擾。

1.2.3 β-半乳糖苷酶 β-gal是β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的表達產物，因其能催化乳糖水解，當使用β-gal的顯色底物(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside， X-Gal)時染色呈藍色。利用這一特性可以實現觀察和檢測。但是由于它不能在活體細胞內觀察而少采用。

綜上所述，內源性標記較外源性標記操作復雜，需要將外源基因導入宿主細胞中，這可能會帶來潛在性風險。不同的標記物(外源性的或者內源性的)都有各自的特點，應根據研究目的選擇合適的標記物，并且還需要考慮實驗動物種類、研究的組織類型以及標記物對細胞本身的影響等因素。

2 細胞示蹤標記方式

對于內源性標記物來說，將外源基因導入靶細胞是細胞示蹤的關鍵。依其實現方式的不同可分為單一式標記和復合式標記兩大類型。

2.1 單一式標記細胞示蹤 常見的單一標記包括轉染、轉導和基因打靶。

轉染(transfection)是指真核細胞導入外源DNA而獲得新的遺傳標志的過程。主要包括電擊法、磷酸鈣法、脂質體介導法以及病毒介導法等。但由于轉染對細胞傷害較大，可能影響細胞的正常生長發育，且導入的遺傳標記在細胞內表達效率和穩定性不容易控制等問題，使得這種方法應用較少。

轉導(transduction)是利用腺相關病毒、腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒等工具將外源基因整合到宿主細胞中。這種源于細菌遺傳學的研究手段已經應用于哺乳動物的細胞示蹤。目前一種較為成熟的、應用于細胞示蹤的RCAS逆轉錄病毒體系可以實現在體內指定時間和特定部位控制表達標記[4]。與轉染質粒相比，逆轉錄病毒轉導方式對細胞毒性小，但是它只能標記有分裂能力的細胞，且有時也會發生表達沉默的現象。

基因打靶技術是以胚胎干細胞技術和同源重組技術為基礎的一種定向基因編輯手段，能使修飾后的遺傳信息在生物活體遺傳并穩定表達。在細胞譜系示蹤中應用的位點特異性重組酶(site specific recombinase， SSR)系統就是基因打靶技術發展起來的。SSR主要包括來自酵母的FLP/FRT位點特異性重組系統和來自埃希氏大腸桿菌噬菌體P1的Cre/Loxp重組酶系統[5]，兩者都能在特異性位點切割和連接DNA，而Cre/Loxp系統重組效率更高。Joyner等最早將Cre/Loxp系統應用于體內細胞譜系示蹤研究，證實了En2陽性細胞在小鼠大腦發育中的重要作用[6]。之后，為了解決特異性控制標記時間的問題，科學家對Cre/Loxp系統進行了改造，即通過雌激素受體的配體(如他莫昔芬tamoxifen)調控Cre入核時間，以實現對基因敲除時間點的控制。Barker等[7]就利用了這一升級后的系統，觀察到腸道上皮干細胞在60天內特異性地表達含G蛋白偶聯受體的富含亮氨酸重復序列5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5,Lgr5)基因，最終證明了Lgr5基因為腸道干細胞的標志基因。所以，Cre/Loxp系統的標記方式相比以往的細胞示蹤手段，具有良好的靶向性，很大程度上避免了錯誤標記的問題。此外，Cre/Loxp系統是對基因組進行編輯，能穩定遺傳，所有表達過Cre的細胞及其后代的所有細胞都會被永久地標記，這為細胞譜系示蹤奠定了基礎。目前，Cre/Loxp系統已經廣泛應用于細胞示蹤研究。

2.2 復合式標記細胞示蹤 復合式標記方式比單一標記方式能更準確地指示目的細胞的位置，這引起了研究者的極大興趣。最早的復合式標記小鼠采用的是基于Cre/Loxp系統建立的Z/AP和Z/EG小鼠，它們能通過LacZ染色陽性或者增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)熒光來追蹤被標記的細胞。另一種復合式標記小鼠是雙熒光蛋白mT/mG小鼠，在Cre表達的情況下，mT/mG小鼠相應組織或細胞由表達tdTomato的紅色熒光轉變成表達EGFP的綠色熒光，由于tdTomato和EGFP都具有細胞膜靶向性，因此通過觀察激發光條件下不同顏色的熒光就可以區別出未標記和已標記的細胞，從而極大提高了示蹤的分辨度。此外，還有一種“Brainbow”多熒光標記系統是應用于斑馬魚的復合式標記系統，能使體內不同細胞顯示不同顏色熒光來進行細胞區分和辨識。復合式標記系統以其高分辨度，特別是配合影像學的新進展，將成為今后主要的活體細胞示蹤的標記手段。

3 細胞示蹤成像系統

細胞活體示蹤技術的發展與影像學的發展息息相關。早期細胞示蹤研究時多采用直接觀察法，通過顯微鏡直接觀察組織細胞的動態變化，借助光學成像對細胞形態進行評估。這種操作的優點是簡便迅速，由于不需要對細胞進行任何標記，也就不影響細胞的生長發育，適合研究模式動物的胚胎發育情況。缺點是觀察的胚胎必須具有少量透明的細胞，且無法追蹤胚胎中具有特定表型的細胞。伴隨著復雜的細胞標記物和標記方式的出現，成像技術也逐步得以發展。目前，常用的細胞活體示蹤成像方法有： 光學成像、核磁共振成像和核素成像。

3.1 光學成像技術 光學成像技術利用光學儀器直接檢測活體細胞活動，得到二維平面圖像。光學成像的優點是： 操作簡便，敏感度較高，無創、無毒、無放射性，費用相對較低。由于標記物的不同，光學成像可以分為生物自發光成像和激發熒光成像兩類。目前的光學成像儀器通過裝配離散窄頻帶濾波器和電子可調濾波器，改進光譜分析的計算機軟件算法，引入具有透視能力的高敏感CCD數碼相機，已經廣泛應用于細胞示蹤成像技術。

3.2 核磁共振成像技術 該技術的原理是利用動物組織中氫原子核的核磁共振現象，將所獲得的射頻信號經計算機處理，重建動物體某一層面的數字圖像。核磁共振成像的優點是空間分辨率高、敏感度強，多用于細胞治療領域；缺點是被測物不能含有磁性物質，而且造影對比劑一般都有少許毒性。

3.3 核素成像技術 核素成像的原理是把放射性藥物引入患者的體內，然后在體外檢測藥物發射的γ射線，通過計算機斷層掃描顯像和正電子發射斷層顯像技術，根據檢測到的各器官組織放射活性比例，從而確定細胞在體內的分布和定量關系。核素成像技術的優點是由于核素的發光光譜是連續的，可以選擇任意波長進行成像，且不需要激發光；同時由于顯像技術的高敏感性和特異性，使核素成像的敏感性高于核磁共振成像法。但是它的不足也是很明顯的，主要是成像空間分辨率較低，標記物會產生輻射,帶來輻射泄漏風險，檢測設備也較昂貴等。

近年來，光學成像和其他成像技術相結合形成的多模態分子影像學為細胞示蹤研究打開了新的空間。

例如，IVIS sepctrum成像系統和雙光子顯微鏡的配合使用，具有結構性CT成像和功能性光學成像雙重功能，既能檢測動物體內的生物自發光和激發熒光，還可以結合CT掃描，最終以3D圖形顯示目的細胞的活動狀態。這套系統適用于小動物整體水平的示蹤研究，也能較好地顯示目的細胞在體內所處的解剖位置，經常被應用于腫瘤發生、發展和治療的研究。此外，將光學成像的高靈敏度與核磁共振成像的高分辨率相結合，將光學成像與核素成像相結合以克服核素的半衰期短的局限等，都使我們能夠更好、更直觀地實現細胞示蹤。

4 展望

綜上所述，細胞示蹤特別是新近發展的細胞譜系示蹤的研究對闡釋細胞及其后代分化、發育和遷移等活動有著重要意義。目前，標記示蹤有許多實現方法，但每一種方法都有其優缺點，應根據研究目的不同以及細胞情況或動物實驗類型選擇合適的示蹤方法，并探索多模態標記示蹤技術實現優勢互補，以達到更好的示蹤效果。新的基因編輯技術(如Crispr/Cas9系統)可用來構建各種轉基因工程小鼠，為相關研究提供良好的動物模型。先進的光學設備(如雙光子顯微鏡)的使用，使研究者可以在活體內連續地對標記細胞進行實時示蹤觀察。

隨著生命科學研究的深入，更高效的細胞示蹤技術將與單細胞基因組學相結合開啟細胞生物學和發育生物學研究的新篇章，并對臨床疾病機制和細胞治療研究等產生深遠的影響。