不同花期芍花精油的成分及抗氧化活性研究

權春梅，曹 帥，丁瑞蘋，劉超祥，張晴晴，周光姣

（1.亳州職業技術學院 藥學院，安徽 亳州 236800；2.亳州學院 中藥學院，安徽 亳州 236800）

芍花為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的花，花色艷麗、香氣濃郁，有“一花之下，萬花之上”的美稱。芍花有較高的藥用價值，有抗氧化，抗菌、抗病毒，抗癌，抗神經退行性疾病，抗心血管疾病和抗腎臟、肺纖維化，抗炎活性[1]，同時具有很高的活性氧自由基的清除能力，富含總酚類、黃酮類、多糖物質等活性成分[2]。但是芍花常常被作為廢棄物丟掉而造成極大的浪費。因此對芍花的開發利用勢在必行。芍花一般4月底或5月初花朵初開，先是花蕾期，而后進入盛開期。當前，有不少國內外學者對很多花卉精油的提取工藝及抗氧化活性成分進行了研究[3-7]，但是對不同花期芍花精油的成分及活性研究尚未見報道。

文章利用超臨界CO2流體萃取法對花蕾期和盛開期芍花進行精油的提取，采用氣-質聯用色譜法對其進行成分研究，對比兩種花期芍花精油的成分差異；另外，采用DPPH法和ABTS法對以上兩種花期的芍花精油進行抗氧化活性研究，為芍花的采收期提供依據，同時也為芍花精油作為天然抗氧化劑的開發奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

芍花，采收于安徽省亳州市譙東鎮，經亳州職業技術學院劉耀武教授鑒定為芍藥Paeonia lactifloraPall.的花；CO2（食品級，純度99%以上）；無水乙醚（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20170803）；無水硫酸鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20160809）；DPPH（Sigma公司，批號：43654-357）；ABTS（Sigma公司，批號：30931-67-0）；磷酸二氫鈉（天津市博迪化工有限公司，批號：20170706）；磷酸氫二鈉（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20170312）；過二硫酸銨（江蘇強盛功能化學股份有限公司，批號：20160915）；無水乙醇（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20170312）；娃哈哈純凈水（合肥娃哈哈飲料有限公司）。

1.1.2 儀器

超臨界萃取裝置（HA220-50-06，江蘇南通華安超臨界萃取公司）；搖擺式高速萬能粉碎機（DFY-400，溫嶺市林大機械有限公司）；電子計重計數天平（LQ-1230，上?，幮码娮涌萍加邢薰荆?；電子天平（FA21048，上海菁海儀器有限公司）；蒸餾裝置（上海書培實驗設備有限公司）；UV紫外分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；Trace1310型氣相色譜儀與ISQ單四級桿質譜聯用儀（美國Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 超臨界CO2流體萃取法

依據權春梅[8]等人對超臨界CO2流體萃取芍花精油的方法研究，設置萃取條件分別為萃?、駢毫?2 MPa、萃取Ⅰ溫度35 ℃、分離Ⅰ溫度36.5 ℃、分離Ⅱ溫度35.7 ℃及泵頻率15 Hz，萃取得芍花精油。

1.2.2 芍花精油的GC-MS測定

采用石英毛細管柱TG-5MS，30 m×0.25 mm，載氣為He。程序升溫從40 ℃開始，以4 ℃/min升到150 ℃保持5 min，再以6 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min，載氣He，柱流量1.0 mL/min，進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL，分流比80∶1。

質譜條件：EI源；電離電壓70 Ev，離子源溫度230 ℃，掃描質量范圍（m/z）：30～500。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定

將花蕾期和盛開期的芍花精油、BHT試劑，用無水乙醇作為溶劑，配成濃度分別為1.25、3.12、6.25、12.5、25.0、50.0 mg/L的樣品溶液，參照文獻[12]方法測定待測樣品對DPPH自由基的清除能力。于光徑1 cm的比色皿管內加入6.5×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液2.5 mL，再加入0.5 mL待測樣品溶液，搖勻，室溫下避光放置20 min后測定混合溶液在517 nm處的吸光度。每一濃度下的吸光度平行測3次，結果平均值，清除活性按下式計算：

式中：A1為DPPH溶液2.5 mL+樣品乙醇溶液0.5 mL的吸光度；A2為樣品乙醇溶液0.5 mL+無水乙醇2.5 mL的吸光度；A0為DPPH溶液2.5 mL+無水乙醇0.5 mL。公式中引入A2是為了消除樣品溶液本身顏色對實驗結果的干擾。

1.2.4 ABTS自由基清除率的測定

ABTS自由基清除能力的測定參照文獻[9-11]的方法，用蒸餾水將ABTS配制成7 mmol/L儲備液，將上述儲備液與2.45 mmol/L（NH4）2S2O8水溶液混合均勻，于室溫避光16 h后備用，反應產生ABTS自由基，將ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液（5 mmol/L，pH7.4）稀釋，使其在734 nm下測得吸光度A在0.700±0.020，用無水乙醇將將花蕾期和盛開期的芍花精油、BHT試劑，配成濃度分別為1.25、3.12、6.25、12.5、25.0、50.0 mg/L的樣品溶液，將0.5 mL不同質量濃度樣品溶液與5 mL ABTS+自由基溶液充分混勻，在室溫下放置10 min后每隔5 min測其吸光度A樣品，按下式計算清除率：

A樣品為加樣品溶液后的ABTS+自由基溶液的吸光度，A空白為不加樣品溶液ABTS自由基溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 花蕾期芍花精油的GC-MS分析

花蕾期芍花精油的GC-MS總離子流色譜圖如圖1。

圖1 花蕾期芍花精油的總離子流色譜圖

通過對圖1的分析結合計算機檢索得出該芍花精油含有8種主要化學成分，結果見表1。

表1 花蕾期芍花精油的主要成分及含量

由表1可以看出，花蕾期芍花精油的主要成分 為[S-（R*，S*）]-N-（3-氨 基-2-羥 基-1-氧代-4-苯丁基）-L-亮氨酸（烏苯美司），含量高達63.22%，除此之外還有苯甲酸，相對含量為19.92%，另外含有少量的其他醇。

2.2 盛開期芍花精油的GC-MS分析

盛開期芍花精油的總離子流色譜圖如圖2。

圖2 盛開期芍花精油的總離子流色譜圖

通過對圖2的分析結合計算機檢索可以得出該芍花精油含有10種主要化學成分，結果見表2。

表2 盛開期芍花精油的主要成分及含量

由表2可以看出，盛開期芍花精油的主要成分為3-甲基-1，6-庚二烯-3-醇，含量達45.69%，另外還含有13.16%的苯甲酸，除此之外還含有其他的醇類及少量的酮。

2.3 不同花期芍花精油對DPPH自由基的清除能力

通過實驗得出花蕾期和盛開期芍花精油對DPPH自由基的清除率結果見圖3。

圖3 清除DPPH自由基的能力

通過圖3可以看出兩種花期的芍花精油對DPPH自由基的清除能力均隨著精油濃度的增大而增強，相同濃度下花蕾期的芍花精油對DPPH自由基的清除能力稍高于盛開期的芍花精油，但二者對DPPH自由基的清除率均小于BHT。在1.56-50 mg/mL濃度范圍內，以α=0.05檢驗水平，兩者對DPPH自由基的清除率整體差異明顯。

2.4 不同花期芍花精油對ABTS自由基的清除能力

通過實驗得出花蕾期和盛開期的芍花精油對ABTS自由基的清除率結果見圖4。

圖4 清除ABTS自由基的能力

通過圖4可以看出兩種花期的芍花精油對ABTS自由基的清除率能力均隨著精油濃度的增大而增強，相同濃度下花蕾期的芍花精油對ABTS自由基的清除能力明顯高于盛開期的芍花精油，但二者對ABTS自由基的清除率均小于BHT。在1.56-50 mg/mL濃度范圍內，以α=0.05檢驗水平，兩者對ABTS自由基的清除率整體差異明顯。

3 結論

通過以上實驗可以看出，花蕾期和盛開期的芍花精油的成分差異很大，花蕾期芍花精油的主要成分為[S-（R*，S*）]-N-（3-氨基-2-羥基-1-氧代-4-苯丁基）-L-亮氨酸（烏苯美司），該成分具有提高免疫力的功能，臨床上常用于抗癌化療、放療的輔助治療，老年性免疫功能缺陷等。因此，對于花蕾期芍花精油進一步的分離及研究將具有重要意義。

以上實驗研究也表明，在相同濃度下花蕾期的芍花精油對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力均高于盛開期的芍花精油。另外，兩種花期的芍花精油對ABTS自由基的清除能力均高于對DPPH自由基的清除能力。綜合課題組利用超臨界CO2流體萃取法對不同花期芍花精油提取率的研究，從經濟效益及抗氧化活性的角度考慮，建議芍花的采收期為花蕾期。

芍花精油作為一種天然抗氧化劑將有很大的潛能，在化妝品、食品、醫療、化工等領域將具有廣闊的應用前景。該研究為芍花的采收期及芍花精油的抗氧化研究奠定了基礎，同時也為提升芍花的附加值拓寬了途徑。