基于密碼子優化策略的厚殼貽貝幾丁質酶原核重組表達及功能

劉宏漢，侯召東，王恒偉，范美華，王健鑫，廖 智

（1.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，海洋生物蛋白質工程實驗室，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學創新應用研究院，浙江舟山 316021）

作為地球上最重要的碳源物質，幾丁質是世界上最豐富的生物大分子之一，對地球的碳循環以及生態系統的維持具有極為重要的意義。幾丁質酶是催化水解幾丁質中β-1，4糖苷鍵的酶，在生物中廣泛存在[1]。根據幾丁質酶的催化特點，可以分為內切酶和外切酶兩大類，兩者的催化位點存在差異[2]。不同物種來源的幾丁質酶存在明顯的功能多樣性。例如，微生物幾丁質酶主要與其細胞壁合成，營養有關[3-5]；昆蟲幾丁質酶則與昆蟲的發育以及蛻皮有關[6]；植物幾丁質酶與植物的生長發育以及免疫有關[7]；人體中的幾丁質酶則被認為與免疫防御以及部分疾病有關[8-12]；因而在臨床上具有重要的研究意義；此外，部分生物的抗菌肽也發現具有幾丁質酶類似結構域，如Tachycitin[13]、Penaeidin[14]等均具有幾丁質結合結構域，這也進一步證實了幾丁質酶參與了免疫功能。在貝類中，幾丁質酶還被發現與貝殼的形成有關聯，屬于貝殼基質蛋白的一種，參與了貝殼中幾丁質的代謝[15]。這表明在貝類中，幾丁質酶也參與了多種生物學功能，因此，對貝類幾丁質酶的研究有助于了解這一分子的分子機化機制。

厚殼貽貝Mytilus coruscus是我國重要的養殖貝類，在前期工作中，從厚殼貽貝血清中分離到一種抗菌肽，該抗菌肽分子量為6.3 kDa，序列全長為54個氨基酸殘基，其序列中含有典型的幾丁質結合結構域，因而命名為mytichitin-CB[17]；該抗菌肽的全長cDNA基因（命名為mytichitin-1）經克隆后發現該基因編碼一段由446個氨基酸殘基組成的前體蛋白，該前體蛋白與來自其他物種的幾丁質酶具有較高的序列相似性[17]；而之前鑒定的抗菌肽mytichitin-CB是該前體蛋白C端55個殘基的裂解產物。這表明厚殼貽貝幾丁質酶mytichitin-1存在體內裂解現象，即厚殼貽貝幾丁質酶通過將其C端的幾丁質結合結構域（mytichitin-CB）裂解，并釋放入血液，作為抗菌肽參與厚殼貽貝的免疫防御。這也是首次發現幾丁質酶存在體內裂解現象，該現象與魚類組蛋白樣抗菌肽的產生機制類似[18]。上述結果表明厚殼貽貝mytichitin可能是一種多功能的幾丁質酶，但是由于mytichitin在厚殼貽貝體內含量極低，因此很難通過常規的蛋白質分離純化手段獲得天然mytichitin開展研究。重組表達是獲取蛋白質分子的重要手段。目前幾丁質酶的重組表達已先后在大腸桿菌[19]，酵母[20]，昆蟲細胞[21]，植物[22]等表達體系中獲得成功。上述表達體系中，大腸桿菌重組表達依然是最為成熟的表達策略，但是面臨的一個問題就是大腸桿菌存在密碼子偏愛性而導致在表達真核生物的重組蛋白時存在效率低下甚至表達不成功的問題[23-24]。解決這一問題的主要辦法是將目標基因的密碼子替換為大腸桿菌偏愛密碼子[25]。為此，采取了密碼子優化策略，對厚殼貽貝mytichitin-1基因按照大腸桿菌偏愛密碼子進行了重新設計和優化；進一步利用原核重組表達策略，獲得厚殼貽貝mytichitin-1重組蛋白，在此基礎上，對厚殼貽貝重組mytichitin-1開展了分離純化、鑒定及功能分析。上述研究結果為后續幾丁質酶的分子改造以及相關功能機制研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝幾丁質酶全酶目標基因的設計、優化與合成

厚殼貽貝幾丁質酶mytichitin-1基因全長為1 341 bp，其genebank數據庫編號為AHC08445，編碼一個含有信號肽序列的446個氨基酸殘基組成的前體蛋白。去除其信號肽序列后，其成熟肽序列基因總長為1 266 bp（含終止密碼子）。根據厚殼貽貝幾丁質酶成熟肽基因序列設計表達目標基因，采用大腸桿菌表達體系開展重組表達研究。因貽貝為真核生物，因此，采用大腸桿菌偏愛密碼子替代目標基因中的部分密碼子；同時，結合pET-28a表達質粒的序列特征和插入位點，在目標基因的兩端設計并添加了酶切位點和六聚His標簽。其中，在目標基因5’端設計Nco I（CCATGG）酶切位點序列和多聚組氨酸標簽序列（CATCATCATCATCATCAC），為防止閱讀框移位，在Nco I酶切位點和多聚組氨酸標簽序列之間添加保護堿基CA；此外，在目標基因3’端終止密碼子（TAA）之后添加Xho I（CTCGAG）酶切位點；設計后的目標基因序列利用DNA化學合成技術由南京金斯瑞公司合成。

合成后的目標基因經測序驗證無誤后，采用Nco I和Xho I進行雙酶切。表達載體pET28a同樣經Nco I和Xho I雙酶切。采用T4-DNA連接酶將純化后的目標基因與pET28a質粒酶切片段進行連接；連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37°C過夜培養。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送上海生工生物公司測序驗證。

1.2 重組mytichitin-1蛋白的表達、復性及分離純化

將成功構建的重組表達質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）表達菌株感受態細胞中，涂布于含卡納霉素的LB平板培養基中，37°C培養過夜。挑取單克隆菌落，于相應抗性的LB液體培養基中培養過夜。菌液按照1：100比例擴大培養。設置37°C和15°C兩種培養溫度分別培養，轉速為200 r/min。在菌液OD630值為0.6～0.8時加入IPTG（1 mmol/L）進行誘導。37°C培養的菌株IPTG誘導時間為4 h；15°C培養的菌株IPTG誘導時間為16 h。

IPTG誘導結束后，收集菌液于1 000×g離心10 min，用預冷的PBS緩沖液洗滌，收集菌體并以裂解液（10 mmol/L 咪唑，50 mmol/L PBS，0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）重懸，冰浴超聲破碎（工作 10 s，間隙10 s，工作90次），低溫8 000×g離心15 min分別收集上清和沉淀（包涵體）。以緩沖液A（10 mmol/L咪唑，8 mol/L 尿素，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L PBS，pH 8.0）溶解包涵體，之后 8 000 ×g離心 15 min，收集上清液，經0.45 μm微孔膜過濾后上樣預先經緩沖液A平衡的鎳柱。之后以緩沖液B（30 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L PBS，pH 8.0）洗柱；再以緩沖液 C（300 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L PBS，pH 8.0）洗脫目的蛋白。

經鎳柱純化后的目標蛋白采用透析復性策略。分別配置復性液I，II和III，其中復性液I配方為：4 mol/L尿素，0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol/L還原型谷胱甘肽，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；復性液II配方為：2 mol/L尿素，0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol/L還原型谷胱甘肽，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；復性液III配方為：0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol/L還原型谷胱甘肽，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；目的蛋白依次在上述3種復性液中進行4°C攪拌透析（截留分子量為1 kDa），透析時間均為24 h。

復性后的目標蛋白采用反相高效液相色譜進行進一步純化。高效液相色譜儀為Waters600 E型（美國，Waters公司），檢測器為Waters 2487雙波長紫外檢測器；色譜柱為C8反相色譜柱（Vydac，218TP）；采用線性梯度洗脫，即B液（含0.1%三氟乙酸的乙腈）在30 min內，其比例由20%上升至50%，A液為含0.1%三氟乙酸的純水；流速為1 mL/min；檢測波長為280 nm。

1.3 重組mytichitin-1的鑒定

SDS-PAGE采用4%濃縮膠結合12%分離膠，樣品事先以電泳上樣緩沖液（上海生工公司）溶解；以牛血清白蛋白（上海生工公司）作為定量分析對照；樣品上樣量為15 μL。采用80 v濃縮膠和120 v分離膠的恒壓模式電泳。電泳結束后以考馬斯亮藍R250進行膠染色并觀察。

Western印跡分析按如下方法進行。首先將電泳分離后的蛋白膠轉印至PVDF膜。因所表達的目標蛋白含有多聚組氨酸標簽（His-tag），因此，膜經洗滌和封閉后，采用鼠抗His-tag抗體（南京金斯瑞公司，貨號A00186）進行孵育過夜，之后再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（南京金斯瑞公司，貨號A00160）孵育60 min，以ECL化學發光試劑進行顯影。

對經HPLC純化后的重組蛋白開展串聯質譜分析，用以驗證所表達的蛋白的序列是否正確；所用質譜儀為4700型串聯飛行時間質譜儀（4700 Proteomics Analyzer TOF/TOFTM，美國Applied Biosystems公司）。蛋白樣品經還原烷基化以及胰蛋白酶酶解后上樣質譜儀；質譜分析工作電壓為20 kV，采用正離子模式，自動模式采集數據。PMF質量掃描范圍為700～3 600 Da，以強度最大的8個峰進行二級質譜分析；譜圖用myoglobin酶解肽段進行外標校正。根據肽段的理論序列生成理論胰酶酶切肽段質量與肽指紋圖進行比對，質量相符的肽段進一步進行串聯質譜譜圖分析，獲得其對應的氨基酸序列并與理論氨基酸序列進行比較。

1.4 重組mytichitin-1的功能分析

幾丁質酶的酶解活性采取DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定。幾丁質購自sigma公司（貨號c9752）；重組mytichitin-1樣品溶于0.1 M的PBS緩沖液（pH=7），加入底物幾丁質后于37°C孵育反應90 min；離心后（12 000 g，10 min），上清液中加入事先配置的DNS溶液（含20%酒石酸鈉鉀，1%氫氧化鈉，0.2%苯酚，0.05%亞硫酸鈉和1%的DNS），煮沸反應10 min后測定540 nm吸收值。以標準濃度的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）為底物制作標準曲線，根據標準曲線得到反應產生還原糖的含量并計算相應的酶活力。酶活力單位（U）定義為1 min內產生1 μMN-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。蛋白含量測定采用蛋白質定量試劑盒（上海生工）依據說明書進行。

抑菌活性實驗采取生長曲線抑制法進行測定。細菌用LB液體培養基培養至對數生長期（OD630為0.01）；重組蛋白樣品以滅菌純水溶解，以純水作為陰性對照；將樣品溶液加入菌液中，終濃度為50 μmol/L，樣品和菌液充分混合后置于恒溫箱37°C培養10 h。采用酶標儀測定OD630值以衡量多肽對于細菌生長的抑制作用。重組蛋白樣品對細菌的相對抑制率根據實驗組（1-實驗組吸光值/對照組吸光值）×100%進行計算。

幾丁質結合活性采取幾丁質孵育結合SDS-PAGE法測定。將重組蛋白樣品配置成1 mg/mL濃度（樣品1）；加入適量幾丁質，充分震蕩混勻后室溫下孵育1 h，再經離心處理（4°C，12 000 g，15 min），收集上清液（樣品2）；沉淀部分加入8 M尿素，震蕩混勻1 h后，離心收集上清（樣品3）。利用SDS-PAGE分別對樣品1、2、3進行電泳分析；分離膠濃度為12%。樣品按1：1加入電泳上樣緩沖液（上海生工公司）；電泳上樣量為20 μL；采用120 V恒壓模式電泳。電泳結束后以考馬斯亮藍R250進行膠染色并觀察。

2 結果

2.1 mytichitin-1基因的設計和密碼子優化

天然mytichitin-1的成熟肽區域基因長度為1 266 bp，經重新設計和優化，目標基因長度為1 298 bp，兩者的序列比對如圖1所示。重新設計的目標基因與天然mytichitin-1序列的一致性為68%。

設計后的目標基因編碼一條長度為429個氨基酸殘基組成的重組蛋白（圖2），與天然mytichitin-1相比，重組mytichitin-1在N端多出一段MAHHHHHH肽段，其余序列與天然mytichitin-1一致。

進一步對優化后的目標基因開展密碼子適應指數（Codon Adaptation Index，CAI）分析，結果如圖3所示。mytichitin-1基因在優化前，其CAI值經OptimumGeneTM軟件在線（http：//www.genscript.com.cn/technology-support/on-line-tools）計算，為0.62；經優化后，其CAI值達到了0.97。CAI值大于0.8則意味著該目標基因在大腸桿菌中的表達效率較高[25]。

2.2 重組mytichitin-1的表達、純化與鑒定

mytichitin-1重組菌經IPTG誘導表達后，收集重組菌菌體，經超聲破碎和離心后，上清與沉淀部分分別以SDS-PAGE進行檢測，結果如圖4所示。從圖4A可以看出，目標蛋白主要表達于沉淀部分，呈包涵體表達特征。目標蛋白條帶約為50 kDa，與重組mytichitin-1的理論分子量（49.1 kDa）接近。進一步經western blot檢測，所表達的目標條帶能與抗組氨酸抗體結合并產生特異性亮帶，表明所表達的重組myti-chitin-1帶有多聚組氨酸標簽（圖4B）。

圖1 重組mytichitin-1基因優化前后核苷酸序列比對圖Fig.1 Sequence alignment of mytichitin-1 gene before （seq1）and after （seq2）OptimumGeneTMoptimization

圖2 Mytichitin-1基因優化后的核苷酸與推導的氨基酸序列比對圖Fig.2 The deduced amino acid sequence of recombinant mytichitin-1 gene

圖3 Mytichitin-1基因經優化前后的密碼子使用偏好性分布比較圖Fig.3 The distribution of codon usage frequency along the gene sequence of mytichitin-1

圖4 重組mytichitin-1蛋白在大腸桿菌BL21表達后SDS-PAGE分析（A）和Western blot分析（B）Fig.4 SDS-PAGE with Coomassie blue staining of recombinant myticusin （A）and western blot analysis of recombinant mytichitin-1 （B）

重組mytichitin-1經鎳柱分離，以不同濃度的咪唑溶液洗脫，洗脫后的組分以SDS-PAGE進行驗證，結果如圖5A所示；從圖5A可以看出，重組mytichitin-1在鎳柱分離時，300 mM咪唑溶液可以充分洗脫目標蛋白；經鎳柱純化后的重組mytichitin-1經復性處理后，再經HPLC純化，結果如圖5B所示。從圖5B可以看出，復性后的mytichitin-1經HPLC分離，以單峰形式被洗脫，表明其純度較高。

圖5 重組mytichitin-1分離純化圖譜Fig.5 Isolation and purification of recombinant mytichitin-1

為驗證純化后的mytichitin-1的氨基酸序列，進一步收集目標峰開展酶解后串聯質譜分析，共分析3個肽段，分子量分別為 1 703.69（圖 6A）、1 831.78（圖 6B）和 1 853.80 Da（圖 6C）；3 個肽段的序列分析結果分別為“-HNFDGLDLDLEYPR-”、“-HNFDGLDLDLEYPRK-”和“-IAADLDFINLMAYDLR-”，分別對應重組mytichitin-1分子序列中第124～137、124～138和194～209肽段；上述結果表明重組蛋白的序列正確，表達成功。

圖6 復性及純化后的重組mytichitin-1質譜分析圖Fig.6 LC-MS/MS spectrum of recombinant mytichitin-1

2.3 重組mytichitin-1的功能

采用DNS法分別測試了重組菌發酵液，鎳柱純化后的重組mytichitin和復性后的mytichitin-1的功能，結果如圖7A所示。從圖7A可以看出，含重組mytichitin-1的大腸桿菌發酵液（fermentation broth，FR）具有一定的幾丁質酶酶解活性；復性前（before refolding，BR）的重組mytichitin-1其幾丁質酶解活性較弱，而復性后（after refolding，AR）的重組mytichitin-1則活性較強。復性后的重組mytichitin-1的功能分析結果如圖7B-D。從圖5A可以看出，重組mytichitin-1對幾丁質的催化在50 min左右達到最高值；而重組mytichitin-1催化幾丁質降解活性在pH值為4左右（圖7B），以及溫度在40°C左右（圖7D），其活性最強。

圖7 重組mytichitin-1活性檢測圖Fig.7 Chitinase activity of recombinant mytichitin-1

采用生長曲線抑制法測定重組mytichitin-1對藤黃疊球菌Sarcina lutea（ATCC4698）、鰻弧菌Vibrio anguillarum（ATCC43306）、黑曲霉 Aspergillus niger（ATCC16404） 以及白色念球菌 Monilia albican（ATCC10231）的相對抑制率，結果如圖8A所示。從圖8A可以看出，重組mytichitin-1在50 μmol/L濃度下，對上述4種微生物的相對抑制率分別為33%、54%、65%和72%。

重組mytichitin-1的幾丁質結合實驗結果如圖8B所示，采用幾丁質孵育結合SDS-PAGE法檢測mytichitin-1的幾丁質結合活性，從圖8B可以看出，mytichitin-1與幾丁質具有明顯的結合活性，在與幾丁質孵育1 h并離心后，上清液經SDS-PAGE檢測無目標條帶（圖8B泳道2）。該結合活性可被8 M尿素解除（圖8B泳道3）。

圖8 重組mytichitin-1的抑菌試驗和幾丁質結合實驗結果圖Fig.8 The antimicrobial activity and chitin-binding activity of recombinant mytichitin-1

3 討論

幾丁質酶作為一種分布極為廣泛且存在多種生物學功能的酶，歷來是酶學研究的重要對象。厚殼貽貝幾丁質酶mytichitin-1的序列中含有一個催化結構域（N端）、一個幾丁質結合結構域（C端）以及連接兩個結構域的接頭序列。在前期研究中，發現mytichitin-1其C端55個殘基的多肽可在體內裂解并作為抗菌肽（mytichitin-CB）分泌至血淋巴中發揮免疫防御作用[17]。該裂解現象在其他物種的幾丁質酶研究中也有少量發現。例如，GAL，et al[26]曾經報道過粘質沙雷氏菌Serratia marcescens的52 kD幾丁質酶可通過裂解產生另一種35 kD的幾丁質酶，兩種酶的催化活性類似，但其裂解的生物學意義不清楚；此外，NAUMANN，et al[27]發現，植物的IV型幾丁質酶可被真菌蛋白酶裂解成兩個片段，分別為酶催化活性域和幾丁質結合結構域，這種裂解可能是植物在遭受真菌侵害時的一種免疫防御機制。由此可見，厚殼貽貝幾丁質酶mytichitin-1的體內裂解現象不是個例，可能在不同物種中均存在此類現象并與該物種的免疫防御機制存在重要聯系。因此，本研究以厚殼貽貝mytichitin-1為研究對象，采取了密碼子優化策略結合原核重組表達獲得重組蛋白樣品并開展相關功能研究。

采用密碼子優化結合原核重組表達策略，成功表達出mytichitin-1的重組蛋白，其表達量達到40 mg/L發酵液。通過western、質譜等手段驗證重組mytichitin-1的序列表達正確。進一步的功能分析表明，重組mytichitin-1具有明顯的幾丁質降解活性，表明重組mytichitin-1在N端的組氨酸標簽并未對其功能產生明顯影響；此外，重組mytichitin-1在氧化復性后，其活性明顯比復性前要強（P＜0.01）。這表明氧化復性有利于重組mytichitin-1的正確折疊，特別是重組mytichitin-1的C端幾丁質結合結構域含6個半胱氨酸并形成3對二硫鍵[17]，因此，氧化復性能促進其二硫鍵的正確配對并確保其功能的正常發揮。同時，我們也注意到，含有重組mytichitin-1的大腸桿菌發酵液也具有一定的幾丁質酶解活性，考慮到重組mytichitin-1在大腸桿菌15°C誘導培養時，其發酵液中也存在少量重組蛋白（圖4B的9號泳道），表明含重組mytichitin-1的大腸桿菌在低溫誘導培養下可能存在少量的分泌型表達方式，但是也不排除該酶解活性可能來自于大腸桿菌自身的幾丁質酶的影響。重組mytichitin-1的酶解活性最佳pH為4左右，這可能與其活性位點（-DGLDLDLE-）富含酸性氨基酸（谷氨酸及天冬氨酸）有關聯[17]；重組mytichitin-1的最佳催化溫度為40°C左右，且在60°C條件下仍保持約70%的活性，表明重組mytichitin-1具有較好的熱穩定性，該特征也與其他物種的幾丁質酶類似[28-29]。幾丁質酶的序列中多數情況下存在幾丁質結合結構域，該結構域與幾丁質酶與底物的結合具有關聯，且該結構域被認為是幾丁質酶能降解不溶性幾丁質的關鍵因素，因此，缺失這一結構域的幾丁質酶只能降解可溶性幾丁質，二不能催化不溶性幾丁質的降解[30]。幾丁質酶中的幾丁質結合結構域根據其二硫鍵數量可分為I型（4對二硫鍵）和II型（3對二硫鍵）[31]；重組mytichitin-1的幾丁質結合結構域含3對二硫鍵，屬II型結構域。在本研究中，重組mytichitin-1對幾丁質具有明顯的結合活性，且該活性在加入尿素促使蛋白變性后得到解除（圖8A）。

抑菌活性實驗表明，重組mytichitin-1對所測試4種微生物均有抑制作用，且表現出對真菌的抑制活性較強，對革蘭氏陰性菌的抑制活性較弱。在所測試的4種菌中，重組mytichitin-1在50 mol/L濃度下對2種真菌的抑制率均在60%以上，而對鰻弧菌和藤黃疊球菌的抑制率相對較低。幾丁質酶的抑菌活性已有相關報道，且多數集中在幾丁質酶的抗真菌活性方面[32-33]。此外，針對貝類的幾丁質酶研究也發現該酶與貝類的免疫防御存在相關性，在細菌誘導下，貝類的幾丁質酶的表達量呈明顯上升趨勢[34-35]。但是與天然mytichitin-CB（mytichitin-1的C端肽）相比[17]，重組mytichitin-1的抑菌活性相對較弱，這表明，厚殼貽貝mytichitin-1通過裂解獲得抑菌活性更強的多肽片段可能是幾丁質酶發揮免疫防御作用的一種重要方式。

貝類幾丁質酶目前被認為與貝類的發育[35]、消化[36]、貝殼的形成[37]和免疫[38]等生理功能存在重要關系。因此，對貝類幾丁質酶的研究不僅有助于了解幾丁質酶的功能多樣性，也有助于了解幾丁質酶參與不同生理學功能的分子機制，從而為幾丁質酶的分子進化研究以及基于幾丁質酶的應用研究奠定基礎。對厚殼貽貝幾丁質酶mytichitin-1的原核重組表達及功能分析，為幾丁質酶結構與功能關系研究以及在此基礎上的蛋白質工程研究奠定了基礎。