豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗與LT蛋白配伍經黏膜途徑接種小鼠免疫效果分析

李本強,陶 潔,程靖華,馬玉飛,劉 雷,劉惠莉*

(1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海種豬工程技術研究中心，上海201106；2上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海201106)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種急性、熱性傳染病[1]，在世界各地幾乎都有發生，是近年來引起世界養豬業嚴重經濟損失的重要疾病之一[2-3]。我國于1996年首次從豬群中檢測到PRRSV，確認該病毒在我國豬群也存在。有研究報道，豬繁殖與呼吸綜合征在我國危害最為嚴重，發病率可達99%，死亡率在50%—100%，給豬場和養豬戶造成了極大的經濟損失[4],嚴重影響我國養豬業的發展。目前對該病尚無有效的治療方法，控制該病的主要方法仍是傳統的免疫接種預防。國內采用的PRRS疫苗主要有滅活疫苗和活疫苗。滅活疫苗雖安全性好，但存在著免疫劑量大、次數多，且產生抗體水平的時間長，有時免疫后產生的抗體水平難達到預期的效果。活疫苗具有免疫效果好、免疫期長等優點，但有時會因為抗原性減弱而導致免疫原性受到限制，而且帶毒時間長，很容易造成毒力返強、毒株重組等問題。

黏膜免疫系統是免疫網絡的重要組成部分，是機體抵抗感染的第一道防線。它通過中和病毒和介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)等機制來行使其多種生物功能。滴鼻免疫可以使上呼吸道黏膜產生強的免疫反應，同時下呼吸道和胃腸道也能特異性分泌抗原特異性IgA和IgG。大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichiacoliheat-labile enterotoxin，LT)是一種很強的黏膜免疫原，起到佐劑的功能，經黏膜途徑免疫后，能刺激機體產生高水平的針對抗原的黏膜IgA，被認為是目前最具潛力的黏膜佐劑之一[5-6]。黏膜免疫可在病原尚未侵入機體的定殖階段即終止感染，減少病原對動物體的損傷，同時減少與注射導致的相關疫病的傳播[7]。

PRRSV主要通過呼吸道感染途徑傳播[8]，通過局部黏膜接種的方式，利用抗原與黏膜受體結合的占位作用，可有效阻斷野毒經黏膜途徑感染，達到很好的預防效果。本試驗以現有PRRS疫苗(勃林格TJM-F92株)為基礎，通過與黏膜佐劑LT配合免疫小鼠，探討PRRS疫苗經黏膜途徑免疫接種的可行性。

1 材料與方法

1.1 疫苗及LT蛋白佐劑

高致病性PRRSV活疫苗(TJM-F92株)購自上海勃林格殷格翰藥業有限公司；PRRSV細胞毒(SH-1)由上海市農業科學院彭麗英老師饋贈。LT蛋白參考唐思靜等[9]方法由本實驗室制備、保存。

1.2 主要試劑

Trizol Reagent、M-MLV Reverse Transcriptase、Recominant Rnase Inhibitor、PrimeScriptRT reagent Kit RT with gDNAEraser購自Takara公司；TransStart Top Green qPCRSuperMix、PFU購自全式金公司；ELISA酶標板購自Thermo公司。

1.3 主要儀器

酶標儀購自Biotek公司；PCR儀和凝膠成像分析系統購自BIO-RAD；7500 Real Time PCR System購自ABI公司。

1.4 實驗動物

1.5 試驗分組及免疫

將小鼠隨機分成4組，每組5只。第一組為對照組，注射生理鹽水，0.2mL只；第二組滴鼻免疫高致病性PRRS活疫苗(TJM-F92株)，0.2mL只；第三組滴鼻免疫添加LT(4 μg只)的高致病性PRRSV活疫苗，0.2mL只；第四組注射免疫高致病性PRRS活疫苗(TJM-F92株)，0.2mL只。間隔14 d進行二次免疫。

分別在一次免疫的第7天和第14天、二次免疫的第7天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天收集小鼠鼻洗和糞便樣品。同時采集血液并分離上清，-70℃凍存備用[10]。

1.6 ELISA檢測IgG和IgA

以實驗室保存的PRRSV細胞毒(SH-1)被酶標孔，每孔100 μL，4℃過夜，PBST洗滌5次；每孔加入250μL含5%脫脂乳的PBST封閉液，37℃封閉2 h，洗滌3次；加入稀釋后的待檢樣品(血清1∶100稀釋，糞便上清1∶3稀釋)，每孔加100 μL樣品，37℃孵育1.5h，洗滌3次；加入二抗100μL(HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)；HRP標記的羊抗鼠IgA(1∶10 000)，37℃孵育1h，洗滌3次；加底物液顯色，37℃避光顯色10min；每孔加50 μl 的2 molL硫酸終止反應，10 min內測定結果；利用酶標儀OD450讀數。

1.7 熒光定量PCR檢測細胞因子表達量

將采集的小鼠脾臟組織研磨，取250μL研磨后的組織懸液，利用Trizol試劑進行總RNA的提取，利用TAKARA公司的RT reagent kit with gDNA eraser試劑盒進行反轉錄，利用全式金的TransStart Top Green qPCRSuperMix進行Real-time PCR。

2 結果與分析

2.1 小鼠血清IgG抗體檢測

PRRSV免疫小鼠試驗，ELISA檢測IgG結果顯示，二免7 d后，3個免疫組小鼠體內IgG抗體水平均有顯著性升高。從一免14 d開始，PRRSV注射組與PRRSV+LT滴鼻組小鼠的IgG水平均高于 PRRSV滴鼻組；PRRSV+LT滴鼻組IgG水平與PRRSV注射組相比，差異不顯著(圖1)。

2.2 小鼠鼻洗液IgA抗體檢測

ELISA檢測小鼠鼻洗液IgA，結果顯示，除了對照組，各組小鼠IgA水平從一免7d開始即呈現上升趨勢。二免21 d開始，PRRSV滴鼻組、PRRSV+LT滴鼻組和PRRSV注射組IgA水平明顯升高，且維持在較高水平，其中PRRSV+LT滴鼻組升高最快，且高于PRRSV滴鼻組和PRRSV注射組(圖2)。

圖1 免疫小鼠血清IgG抗體檢測Fig.1 IgG antibody levels of mice after first and second immunization

圖 2 免疫小鼠黏膜IgA抗體檢測Fig.2 IgA antibody levels of mice after first and second immunization

圖3 免疫小鼠后黏膜IgA抗體檢測Fig.3 IgA antibody levels of mice after first and second immunization

2.3 小鼠糞便IgA抗體檢測

ELISA檢測糞便IgA結果顯示，免疫早期，各組小鼠糞便IgA抗體均較低；二次免疫后21d開始，PRRSV滴鼻組、PRRSV+LT滴鼻組和PRRSV注射組IgA水平出現較明顯的升高趨勢，其中PRRSV+LT滴鼻組升高最快，且高于PRRSV滴鼻組和PRRSV注射組(圖3)。

2.4 脾臟IFN-γ表達水平

如圖4所示，PRRSV+LT滴鼻組小鼠在一免后24h和48h，IFN-γ表達量最高，顯著高于PRRSV注射組，且極顯著高于對照組；而與PRRSV滴鼻組差異不顯著(P>0.05)。

2.5 脾臟IL-10表達檢測

如圖5所示，一免后24h，PRRSV滴鼻組、PRRSV+LT滴鼻組和PRRSV注射組IL-10表達升高，隨后即出現下降趨勢。其中， PRRSV注射組IL-10表達量最高，其次是PRRSV+LT滴鼻組，PRRSV滴鼻組最低。方差分析顯示，PRRSV注射組和PRRSV+LT滴鼻組之間無顯著性差異。

圖4 小鼠脾臟IFN-γ表達量Fig.4 IFN-γ expression levels of mice’s spleens

圖5 小鼠脾臟IL-10表達量Fig.5 IL-10 expression levels of mice’s spleens

3 結論與討論

本研究采用實驗室構建的黏膜佐劑LT，與PRRSV疫苗一起經黏膜免疫小鼠，并與經肌肉注射免疫途徑所產生的免疫應答進行比較，結果發現PRRSV滴鼻免疫也能獲得理想的IgG抗體水平，與注射免疫無明顯差異(P>0.05)。PRRSV疫苗與LT蛋白經滴鼻途徑共免疫小鼠，不僅能夠誘導高水平IgG，而且還能產生理想的局部黏膜IgA抗體。

PRRSV的感染途徑為呼吸系統，依次經過鼻黏膜、扁桃體和PAM細胞，最后擴散到血液和全身[1，8]。PRRSV疫苗免疫目前還是傳統的注射方式，依賴機體產生的抗體抵抗和中和病毒感染，但無法在PRRSV入侵的呼吸道黏膜產生抵抗作用[11-12]。Murtaugh等[13]提出PRRSV疫苗滴鼻免疫能提前產生中和抗體，為PRRSV的免疫接種提供了新的途徑。黨龍[14]采用滴鼻免疫途徑PRRS TJM-F92株活疫苗，發現TJM-F92毒株疫苗的早期定殖為機體啟動防御系統抵抗野毒感染贏得了時間，減輕和杜絕了產房后期和斷奶豬的發病。本研究也證實PRRSV滴鼻組通過滴鼻途徑產生IgG的水平與注射組差異不顯著，且產生IgA的水平高于注射組。

鑒于LT蛋白具有良好的黏膜佐劑功能，研究將LT蛋白與PRRSV疫苗聯合進行滴鼻免疫，且獲得了理想的黏膜免疫效果。Nascimento等[15]用突變體LTAK63和結核分枝桿菌卡介苗免疫后，結果發現免疫后的小鼠產生更強的免疫應答，提供更高的免疫保護。Sing等[16]用突變體LTK63和LTR72和流感疫苗經鼻內給藥共同免疫小鼠，結果顯示添加LT突變體組能夠誘導小鼠血清抗體IgG水平增加。同時Greer等[17]也證明以突變體LTR72作為佐劑，與人HPV-6b混合經滴鼻途徑免疫小鼠，顯著增加了血清中IgG的抗體水平。在本試驗中，PRRSV疫苗與LT混合經滴鼻途徑免疫能夠刺激動物機體產生較好的局部黏膜免疫反應，且強于肌注免疫。這與Accolla等[18]在HIV-1 Tat蛋白研究中應用LT作為黏膜佐劑與Tat蛋白經鼻腔免疫小鼠，可以誘導小鼠產生高水平的IgA結果類似。證明LT蛋白能夠提升PRRSV疫苗經黏膜途徑免疫局部特異性的IgA抗體水平。

IFN-γ是重要的Th1型因子，具有抗病毒作用，可促進細胞介導的免疫應答。研究發現將PRRSV VR-2332突變株接種易感豬，血清中IFN-γ的含量持續升高，受免動物的細胞免疫力持續提升[19]。本研究表明滴鼻和注射免疫均能在免疫后24h誘導IFN-γ產生，且PRRSV+LT滴鼻組誘導的IFN-γ水平高于PRRSV注射組(0.01

本研究表明PRRSV疫苗經滴鼻免疫小鼠，能誘導理想的局部免疫和系統免疫應答，且LT蛋白共免疫能有效提升局部黏膜免疫抗體產生，為阻斷病原黏膜感染提供保護屏障，同時活化Th1細胞，共同參與抗病毒免疫應答，為豬PRRSV疫苗經黏膜途徑免疫提供了依據。