酶解褐藻寡糖的分離制備及其脂蛋白調節作用

陳巖君，竇文芳，李恒，史勁松，許正宏

1(江南大學 藥學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

在正常情況下，人體主要通過肝臟對膽固醇進行攝取，使血液中的膽固醇含量維持在正常范圍之內。在肝臟攝取膽固醇的過程中，低密度脂蛋白受體(low-density-lipoproteinreceptor，LDLR)起主要作用。低密度脂蛋白(low-density-lipoprotein，LDL)是一種運載膽固醇進入組織細胞的脂蛋白顆粒。LDLR是一種膜鑲嵌式蛋白質，能夠攝取血漿中的LDL-膽固醇從而降低其在血漿中的含量，在脂蛋白代謝中起關鍵作用[1-2]。

近年來，蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，PCSK9)被發現是血漿LDL-膽固醇水平的關鍵調節劑[3]。PCSK9是哺乳動物前蛋白轉化酶家族的可溶性絲氨酸蛋白酶[4]，主要由肝臟合成、分泌，在其他組織如腎臟、小腸、中樞神經系統、胰腺、結腸上皮和血管平滑肌細胞有較少的分泌[5-7]。PCSK9分泌到血液中，通過細胞內和細胞外2個獨立的方式與LDLR的表皮生長因子樣重復A(EGF-A)結構域結合，誘導LDLR進入溶酶體降解。當血漿PCSK9水平升高時，肝細胞表面LDLR降解，影響血液中LDL-膽固醇的清除而導致LDL-膽固醇水平升高；當PCSK9含量降低時，LDLR的水平升高，可以轉化更多的LDL-膽固醇[8-9]。因此，PCSK9被認為是預防和治療高膽固醇血癥和心血管疾病的重要靶標。

褐藻膠是一種由海洋褐藻生成的陰離子多糖，是由(1→4)連接的D-甘露糖醛酸(mannuronicacid，M)和其C5異構體L-古洛糖醛酸(guluronicacid，G)組成的線性聚合物，以均聚(MM或GG)或異聚(MG或GM)方式排列組成。主要存在3種結構片段：β-D- (1，4)連接的聚甘露糖醛酸片段(Polymannuronate，PM)，α-L-(1，4)連接的聚古洛糖醛酸片段(polyguluronate，PG)，G與M交替共聚的片段PMG[10-13]。褐藻寡糖可以通過酶解法或物理化學法降解褐藻膠制備。與化學和物理方法相比，酶解法具有高產量、污染小、可生成特定寡糖的優點。研究顯示，褐藻寡糖能夠增加低密度脂蛋白的攝取，可開發成新一代降膽固醇藥物。但生物降解獲得的褐藻寡糖是聚合度不一的寡糖混合物，糖基組成和寡糖活性存在較大差異，嚴重影響了批次穩定性及產品品質，限制了其推廣應用。該文采用IsoptericolahalotoleransCGMCC5336褐藻膠裂解酶制備褐藻寡糖，經分離、純化后得到聚合度均一的寡糖，并研究了不同聚合度寡糖對HepG2細胞LDLR和PCSK9蛋白水平的影響，以期為后續應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜鹽白蟻菌(Isoptericolahalotolerans) CGMCC 5336，本實驗室篩選并保藏的菌株。人肝癌細胞(HepG2)，購自中科院上海細胞庫。

1.2 主要儀器

Bio Gel P2(fine,45-90μm)，美國Bio-Rad公司；機械攪拌玻璃發酵罐Biotech-5JG(5 L)，上海保興生物設備工程有限公司；熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；蛋白電泳裝置，美國Bio-Rad公司；多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不飽和褐藻寡糖的制備

將嗜鹽白蟻菌CGMCC 5336接種于種子培養基，25 ℃、120 r/min培養24 h。按1%接種量(40 mL)接入罐上發酵培養基中培養48 h，8 000 r/min離心10 min去除菌體，用超濾法濃縮酶液，通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定酶的活性。1個酶活力單位(U)被定義為:1 min產生1 μg還原糖所需的褐藻膠裂解酶的量。將海藻酸鈉(12 g)溶解于1 L的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，加入52 200 U褐藻膠裂解酶，40 ℃反應4 h，加水煮沸15 min停止酶反應。8 000 r/min離心5 min除酶。根據大分子多糖和蛋白質不溶于乙醇的特點，通過在酶解液中加入乙醇使其沉淀。將酶解液濃縮至約100 mL，加入無水乙醇至乙醇終濃度為60%，4 ℃沉淀過夜。收集上清液，濃縮并凍干，得到褐藻粗寡糖。

1.3.2 液相條件

色譜儀：WATERS ACQUITY UPLC；分析柱：BEH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動相：A乙腈，B 0.1% 甲酸(A 2%，B 98%，0 min；A 10%，B 90%,8 min)；流速：0.3 mL/min；柱溫：45 ℃；進樣量：5 μL。

1.3.3 質譜條件

離子方式: ESI；毛細管電壓: 3.0 k；錐孔電壓: 20 V；離子源溫度: 100 ℃；脫溶劑氣溫度: 400 ℃；碰撞能量：6/20 Volts；質量范圍(m/z): 20～1 000；Detector電壓: 1 800 V。使用MassLynx 4.1對樣品數據進行分析和處理。

1.3.4 Bio-Gel P-2凝膠層析法分離寡糖

稱取褐藻粗寡糖150 mg，溶于1 mL 1 mol/L NaCl溶液中，用0.22 μm水膜過濾樣品，使用150 cm×1.0 cm Bio-Gel P-2凝膠柱進行分離，流動相為2.5 mmol/L Tris-1 mol/L NaCl溶液，流速為0.1 mL/min。于室溫下進行分離，使用半自動收集器收集樣品，每15 min收集1管。在230 nm測量吸光度值。將收集到的相同組分進行合并。

1.3.5 MTT測定

(1)

1.3.6 熒光定量PCR

根據制造商的說明書使用Trizol提取總RNA。將RNA稀釋至40 ng/mL后，加入引物、模板對其進行反轉錄，PCR條件為：25 ℃，10 min；48 ℃，40 min；95 ℃，5 min；12 ℃，∞。反轉錄總RNA以獲得cDNA。使用SYBR green premix進行qRT-PCR，條件為50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，45個循環擴增。使用下列引物序列：人LDLR，5′-TTGGCTGCGTTAATGTGA-3′(有義)和5′-TGATGGGTTCATCTGACCAGT-3′(反義);人SREBP-2，5′-CAGTGGGACCATTCTGAC-3′(正義)和5′-TTCCTCAGAACGCCAGACTT-3′(反義);人PCSK9，5′-GCTGAGCTGCTCCAGTTTCT-3′(有義)和5′-AATGGCGTAGACACCCTCAC-3′(反義)：以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt對基因的表達水平進行相對定量。

1.3.7 蛋白免疫印跡分析

在6孔板中加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上靜置30 min后收集蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。配制10%分離膠和濃縮膠，每孔蛋白含量為30 μg，80 V條件下使蛋白樣品電泳至分離膠與濃縮膠之間時，調節電壓至100 V，樣品中的溴紛藍跑至電泳槽底時即可停止電泳。

將膠取出，與聚偏氟乙烯膜(PVDF)、濾紙、海綿組成三明治結構，放入轉膜緩沖液中轉膜，然后將轉膜儀置于冰水浴中，100 V恒流轉膜100 min。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后，用TBST洗滌3遍，與一抗4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌3遍，再與辣根過氧化物酶(HRP)-二抗孵育1 h后，用TBST溶液洗滌3遍，加入ECL化學底物發光試劑，凝膠成像儀檢測目的蛋白條帶，利用Image J軟件計算條帶灰度，以GAPDH作為對照。

2 結果與分析

2.1 褐藻寡糖的制備

采用褐藻膠裂解酶對海藻酸鈉進行酶解，得到褐藻粗寡糖命名為FrA。

2.2 LC-MS分析

通過LC-MS對FrA進行分析。其液相分析圖如圖1所示，主要觀察到5個峰，其出峰時間分別為0.65、3.14、3.73、4.46、5.46 min。分別對5個峰進行質譜分析，峰1結果如圖2-a所示，確定該峰為雜質峰。峰2的質譜分析如圖2-b所示，其中質荷比數351、703均可與寡糖的分子量相對應，故可能為二糖或四糖。峰3的質譜分析如圖2-c所示，其中質荷比數527、1055均可與寡糖的分子量相對應，故可能為三糖或六糖。峰4的質譜分析如圖2-d所示，其中質荷比數只有703與寡糖分子量相對應，確定其為四糖。峰5的質譜分析如圖2-e所示，確定其為四糖。則峰2為二糖，峰3為三糖，其所對應的質譜圖分別為二、三糖的質譜圖。二糖質譜圖中的703和三糖質譜圖中的1055可能是兩個糖分子連在一起，即[2M-1]。

圖1 褐藻粗寡糖的液相圖譜Fig.1 The LC analysis of alginate oligosaccharides

圖2 褐藻粗寡糖的質譜圖Fig.2 The MS analysis of alginate oligosaccharides

2.3 凝膠色譜分離

通過Bio-Gel P2凝膠柱對制備得到的褐藻粗寡糖進行分離。使用0.25 mol/L Tris-1 mol/L NaCl緩沖液進行洗脫，上樣量為1 mL，樣品質量濃度為150 mg/mL，流速為0.1 mL/min，通過使用半自動部分收集器對洗脫液進行收集，每管1.5 mL。使用230 nm處的吸收值繪制分離曲線。結果如圖3所示，共得到4個組分，分別標記為Fr1，Fr2，Fr3和Fr4，Fr1中可能含有不同聚合度的寡糖。Fr2-4這3個組分分離度較好，可能為聚合度均一的寡糖。此外Fr1-Fr4分子量依次減小，Fr4的分子量最小。

圖3 Bio-Gel P2洗脫曲線Fig.3 The isolation eluted of Bio-Gel P2

2.4 LC-MS分析

Fr1的液相圖如圖4所示，共含有2個峰，分別為峰1和峰2。在峰1的質譜圖中，如圖5-a，質荷比879可以與聚合度為5的褐藻寡糖的分子量相對應，因此Fr1液相圖中峰1是五糖；峰2質譜圖，如圖5-b，質荷比1065、879、527分別對應于聚合度為6、5、4的褐藻寡糖，由于峰2的分子量較峰1大，故確定Fr1中峰2為六糖。

圖4 Fr1的液相圖譜Fig.4 The LC analysis of Fr1

圖5 Fr1的質譜圖Fig.5 The MS analysis of Fr1

在Fr2-Fr4的液相圖中，如圖6所示，均只含有1個液相峰。與FrA的液相圖譜相比較，Fr2的液相圖如圖6-a，其液相峰保留時間為4.37 min，確定為四糖；Fr3的液相圖如圖6-b 所示，其液相峰保留時間為3.61 min，確定為三糖；Fr4的液相圖如圖6-c所示，其液相峰保留時間為3.12 min，確定為二糖。

圖6 Fr1的質譜圖Fig.6 The MS analysis of Fr1

2.5 不同質量濃度的4種組分對HepG2細胞活性的影響

通過MTT實驗測定不同質量濃度的Fr1-Fr4(0.062 5-1 mg/mL)對HepG2細胞活性的影響。結果如圖7所示。

圖7 Fr1-Fr4對HepG2細胞存活率的影響Fig.7 Cell viability of HepG2 cells exposed with Fr1-Fr4

當用不同質量濃度的4種組分刺激HepG2細胞12 h后，細胞存活率均在80%以上，表明Fr1-Fr4在1 mg/mL以下，對HepG2細胞的毒性較低。

2.6 四種組分對HepG2細胞LDLR基因及蛋白表達的影響

用1 mg/mL的Fr1-Fr4及FrA刺激細胞12 h，通過qRT-PCR檢測4種組分對HepG2細胞LDLR基因表達的影響。結果如圖8所示，Fr4能夠顯著上調LDLR的轉錄水平。

圖8 Fr1-Fr4對HepG2 LDLR基因表達的影響Fig.8 Effects of Fr1-Fr4 on the gene expression of LDLR 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

通過Western Blot檢測4種組分對HepG2細胞LDLR蛋白表達的影響。實驗結果如圖9所示，Fr1、Fr3和Fr4均能顯著上調LDLR的蛋白表達水平，其中Fr4的調節作用最為顯著。LDLR的增加有利于肝細胞對血漿中LDL-膽固醇的攝取，從而降低血漿膽固醇水平。其中Fr4對LDLR蛋白表達水平的上調作用可能與其對LDLR轉錄水平的上調作用有關。而其他組分對LDLR的調節作用主要受其他因素的影響。

圖9 Fr1-Fr4對HepG2細胞LDLR蛋白表達的影響Fig.9 Effect of Fr1-Fr4 on the protein expression of LDLR 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

2.7 四種組分對HepG2細胞PCSK9蛋白表達的影響

通過Western Blot檢測4種組分對HepG2細胞PCSK9蛋白表達的影響，用1 mg/mL的Fr1-Fr4及FrA刺激細胞12 h。結果如圖10 所示，Fr3對PCSK9蛋白表達水平有明顯下調作用，Fr1和Fr2具有上調作用。Fr4對其調節作用不明顯。PCSK9增多，會造成LDLR的降解。當PCSK9被抑制時，LDLR蛋白含量增加。所以，Fr3對LDLR蛋白水平的上調作用可能與其對PCSK9的抑制作用有關。

圖10 Fr1-Fr4對HepG2細胞PCSK9蛋白表達的影響Fig.10 Effect of Fr1-Fr4 on the protein expression of PCSK9 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

2.8 Fr4對HepG2細胞SREBP-2基因表達的影響

LDLR基因表達主要受固醇反應原件結合蛋白-2(SREBP-2)的調控，而Fr4對LDLR轉錄水平有明顯的上調作用。通過qRT-PCR考察Fr4對SREBP-2轉錄水平的調控作用。結果如圖11 所示，Fr4能夠顯著上調SREBP-2轉錄水平。這表明，Fr4對LDLR轉錄水平的上調作用可能與其對SREBP-2的激活作用有關。

圖11 Fr4對SREBP-2基因表達的影響Fig.11 Effects of Fr4 on the gene expression of SREBP-2 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

3 結論

通過Bio-Gel P2凝膠柱對酶解產生的褐藻粗寡糖進行分離純化，得到聚合度均一的寡糖。在分離得到的4個組分中Fr1，Fr3，Fr4均能上調LDLR蛋白水平，其中Fr3和Fr4的活性更顯著。Fr4能夠上調LDLR轉錄水平，Fr3能下調PCSK9的蛋白水平，這表明Fr4對LDLR蛋白水平的調節作用受LDLR轉錄水平的影響；Fr3對LDLR蛋白水平的上調作用與PCSK9的下調有關。而Fr4對LDLR轉錄水平的上調作用可能與SREBP-2的激活有關。