發酵條件對酵母接種醉鱘魚風味的影響

朱露露，楊方,2*，高沛，姜啟興，許艷順，于沛沛，夏文水*

1(江南大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇無錫，214122) 2(徐州一統食品工業有限公司江蘇省博士后創新實踐基地，江蘇徐州，221004)

鱘魚全身是寶，鱘魚肉富含蛋白質和不飽和脂肪，具有較高的營養價值和特殊的保健功能；鱘魚軟骨含有硫酸軟骨素，具有抗癌、抗炎、抗血栓及保護心腦血管等作用[1]。目前，鱘魚人工繁殖技術逐漸成熟，我國鱘魚養殖規模不斷擴大，現已成為鱘魚養殖第一大國。國內外學者對于鱘魚的研究主要集中在營養價值分析[2]、硫酸軟骨素提取[3-4]和蛋白粉的制備[5]等方面。對鱘魚肉產品的開發較少，大量的鱘魚肉成為制作魚子醬的下腳料，造成了資源的浪費。因此，以鱘魚肉作為原料開發大眾食品，將對鱘魚食品產業的發展具有重要意義。

但是，鱘魚肉制成的軟罐頭食品存在鮮香味不足、口味不佳的問題，降低了消費者的接受度和限制了產品規模的擴大。盡管醉制增香工藝在一定程度上改善了鱘魚肉軟罐頭的風味，但香氣仍然不夠濃郁，對消費者的吸引力有待進一步提升。目前生物發酵技術應用于魚制品、肉制品的風味改善已吸引不少學者關注，如UDOMSIL等[6]從自然發酵魚露中篩選出葡萄球菌，并利用該菌株制備魚露，不僅增加了魚露的“黑巧克力”香氣，同時魚露的風味也得到了顯著提升；盧曉莉[7]從傳統發酵魚鲊中篩選出戊糖片球菌和植物乳桿菌，并將2種菌株混合接種發酵魚鲊，成熟后的產品具有更加濃郁的發酵香味；CHEN等[8]從哈爾濱風干腸中分離出戊糖片球菌，并將該菌株接種到豬肉的肌漿蛋白，結果檢測到了最高含量的醇類、酸類以及醛類風味物質；王洋等[9]采用分離自國內外發酵食品的戊糖乳桿菌31-1和松鼠葡萄球菌SL4作為復合發酵劑，制備發酵鱘魚腸，結果顯示發酵鱘魚腸感官品質較好，且具有鱘魚肉制品的特殊風味。然而，酵母發酵能否進一步改善鱘魚肉風味品質還有待研究，其中內涵原因也有待挖掘。

該文旨在開發一種發酵風味濃郁的醉鱘魚產品，并確定關鍵發酵風味物質以及發酵條件對這些風味物質的影響。本論文對鱘魚食品加工產業發展具有重要的現實意義，對類似發酵產品風味分析和工藝改進具有學術參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鱘魚，華大(鎮江)水產科技產業有限公司提供；安琪酵母，安琪酵母股份有限公司提供；香辛料、調味料，購于無錫歐尚超市(高浪店)；高溫蒸煮袋，河北石家莊華信塑業。市售醉魚產品均為距實驗日期一個月內生產的產品。

1.2 儀器與設備

恒溫恒濕培養箱：LHS-250HC-II型，上海一恒科學儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱：DHG-9070A型，上海一恒科學儀器有限公司；真空包裝機：YMX-958-10L型，泉州億閩信機電有限公司；全自動回轉式多功能殺菌鍋：RHS-03-700型，溫州市龍強乳品機械廠；萃取頭：65μm，PDMS/DVB，Supelco，Bellefonte，PA，美國；氣質聯用儀：TSQ Quantum XLS，Thermo Fisher Scientific，美國。

1.3 發酵醉鱘魚的工藝條件

將魚身去內臟、去皮，清洗，切成魚塊；然后，將魚塊按料液比1∶1，置于質量分數為8%的食鹽腌制液中，10 ℃下腌制2 h；將腌制后的魚塊在50 ℃的條件下干燥5 h，冷卻至室溫；將干燥后的魚塊按料液比為1∶1浸入調味液(按質量分數計，40%黃酒，25%香辛料液，25%蔗糖，7%白酒，2%味精，1%食醋)中，并向調味液中接種質量分數為0.8%的干酵母，30 ℃下發酵10 h，香辛料液中各香辛料的質量分數為：0.3%綠茶葉，0.6%茴香，0.3%花椒，0.6%八角，1.2%蔥，1.0%姜；最后采用高溫蒸煮袋真空密封后殺菌，殺菌溫度為121 ℃，恒溫時間11.4 min，反壓冷卻，壓力0.12 MPa。

1.4 試驗方法

1.4.1 感官評價

發酵醉鱘魚的感官評價參考王旋[10]、律佳雪[11]的醉魚感官評價標準，并進行改進。由挑選的12名(6男6女，年齡均在20～35歲之間)受過專業培訓的感官評定人員組成評定小組，對樣品的滋味和香味進行感官評定，評定標準見表1。

表1 發酵醉鱘魚感官評分標準Table 1 Scoring criteria for sensory quality of fermented and wine-aroma sturgeon

1.4.2 揮發性風味成分分析

1.4.2.1 揮發性風味成分的提取

采用頂空固相微萃取技術對樣品中的揮發性成分進行提取，樣品處理參照FRATINI等[12]的方法。將待測樣品充分攪碎后，取2 g置于20 mL頂空瓶中，并向頂空瓶中加入2.5 mL飽和NaCl溶液和100 ppm內標(2,4,6-三甲基吡啶)，充分混勻，萃取頭經老化以后插入樣品瓶中的頂空部分進行吸附，吸附溫度60 ℃，吸附時間30 min，萃取頭經吸附后取出，插入氣相色譜進樣口進行解吸，解析溫度250 ℃解吸時間3 min。

1.4.2.2 GC-MS分析

GC-MS分析條件參照高沛[13]的分析方法。通過標準圖庫NIST2005和Willey 7對樣品的揮發性物質進行定性分析，各待測物質的保留指數(retention index，RI)可以依據C8～C26正構烷烴的保留時間計算得到。對比各待測物質與內標物的峰面積，對樣品中揮發性物質的濃度進行計算，表示為μg/kg。

1.4.3 OAV法確定主體風味成分

通過參考各揮發性物質的氣味閾值[14-15]，計算氣味活度值(odor activity value，OAV)，用于反應某一香氣化合物對于樣品整體風味的貢獻大小[16-17]，計算公式如下：

(1)

式中：C，樣品中揮發性成分的質量濃度，μg/kg；OT，氣味閾值，μg/kg。

OAV < 1，說明該揮發性物質對樣品整體風味沒有實質貢獻；OAV > 1，說明該揮發性物質屬于氣味活性物質，可能對樣品整體風味具有直接影響。

為了更加直觀地評估各組分對樣品整體風味的貢獻程度，在OAV基礎上對各揮發性風味物質的相對氣味貢獻率(relative odor contribution，ROC)進行計算[18]，公式如下：

(2)

式中： OAVi，揮發性物質i的氣味活性值；其中OAVi>1。

ROC越大的組分對樣品整體風味貢獻越大。

1.4.4 發酵條件對發酵醉鱘魚關鍵風味物質的影響

工藝流程參見1.3。

1.4.4.1 酵母菌添加量對發酵醉鱘魚關鍵風味物質的影響

發酵溫度為30 ℃，發酵時間為8 h，設置酵母菌添加質量分數分別為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%進行試驗，研究酵母菌添加量對發酵醉鱘魚關鍵揮發性風味物質的影響。

1.4.4.2 發酵溫度對發酵醉鱘魚關鍵風味物質的影響

發酵時間為8 h，選取上述最佳酵母菌添加量，設置發酵溫度分別為25、28、30、35 ℃進行試驗，研究發酵溫度對發酵醉鱘魚關鍵揮發性風味物質的影響。

1.4.4.3 發酵時間對發酵醉鱘魚關鍵風味物質的影響

選取上述最佳酵母菌添加量和發酵溫度，設置發酵時間分別為4、6、8、10、12 h進行試驗，研究發酵時間對發酵醉鱘魚關鍵揮發性風味物質的影響。

1.4.5 數據處理方法

數據處理和分析使用軟件Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0，計算平均值、標準偏差及進行顯著性分析；數據繪圖采用Origin 8.5。

2 結果與分析

2.1 自制發酵醉鱘魚與市售醉魚產品感官品質比較

將自制發酵醉鱘魚與3種市售醉草魚隨機編碼后，按表1隨機進行感官評定，結果如表2所示，自制發酵醉鱘魚的滋味顯著優于市售醉魚2和市售醉魚3，但與市售醉魚1沒有顯著性差異。自制發酵醉鱘魚的香味顯著優于市售3種醉魚產品，表明引入酵母菌發酵可以有效改善醉魚的風味。這可能是由于酵母菌可以利用碳水化合物進行酒精發酵產生大量的醇類物質，而醇類物質不僅是醉魚產品重要的風味物質，并且還可以和發酵體系中的酸反應生成風味酯[19-20]。

表2 自制發酵醉魚與市售醉魚感官的感官分析比較Table 2 Sensory analysis of self-made products and commercial products

2.2 發酵醉鱘魚關鍵風味物質的確定

對發酵醉鱘魚進行揮發性風味成分分析，其結果如表3所示。共有37種揮發性化合物被鑒定出來，這些化合物包括醇類7種、酯類10種、醛類4種、酸類3種、酮類2種和其他類11種(烷烴類、烯烴類、芳香烴類、呋喃類、酸酐類和含氮化合物)。

醇類化合物是發酵醉鱘魚的主要揮發性風味成分之一。在檢測出的7種化合物(乙醇、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇、糠醇、苯甲醇和苯乙醇)中，含量較高的是乙醇、3-甲基-1-丁醇及苯乙醇等。不同的醇來源不同，有的來自于碳水化合物的發酵，更多的是由于醛和酮被還原成了相應的醇。直鏈飽和醇的氣味閾值較高，對樣品整體風味的貢獻程度不大，但直鏈飽和醇對脂肪酸酯化具有促進作用并且可以賦予產品醇香，如乙醇。而不飽和醇的氣味閾值較低，對整體風味影響較大，如1-辛烯-3-醇，是一種亞油酸氫過氧化物的降解產物，具有蘑菇氣味和發酵香氣，對產品風味具有極高的貢獻度[21]，是臭鮭魚[22]和日本FISH MISO[23]的主要風味成分之一。另外，3-甲基-1-丁醇、異丁醇等支鏈醇通常由碳水化合物的糖酵解(embden-meyerhof-parnas，EMP)途徑以及氨基酸的埃利希途徑降解產生[22]。

酯類化合物是發酵醉鱘魚的另一種主要揮發性風味成分，達10種，其中有7種酯類物質是乙酯類。有研究發現，酵母菌對乙酯類物質的生成具有促進作用。ANDRADE等[24]將漢遜德巴利酵母菌接種到干制發酵臘腸中，結果檢測到大量由短鏈脂肪酸組成的乙酯類物質，如丙酸乙酯、戊酸乙酯等。如表3所示，在鑒定出的酯類物質中含量較高的分別為乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯等。通常由短鏈脂肪酸形成的酯類化合物具有果味香氣，由長鏈脂肪酸組成的酯類化合物貢獻脂肪氣味[25]。

發酵醉鱘魚的醛類化合物包括壬醛、十五醛、3-甲基丁醛和苯甲醛。醛類物質的氣味閾值極低，對樣品整體風味具有重要的貢獻。其中脂肪醛(壬醛、十五醛)由不飽和脂肪酸的氧化作用產生，支鏈醛(3-甲基丁醛)由氨基酸的降解作用產生。苯甲醛是最簡單的芳香醛，具有特殊的杏仁氣味。在肉類制品中，脂肪族醛一般由脂肪或者肌肉組織中內源酶引起的不飽和脂肪酸氧化產生[26-27]。然而，發酵魚制品中微生物對不飽和脂肪酸的氧化作用尚不明確，但目前已有學者研究證明微生物利用氨基酸能夠生成支鏈醛，BECK等[28]將木糖葡萄球菌接種在含有18種氨基酸的培養基里，結果鑒定出大量3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等支鏈醛。

發酵醉鱘魚的酸類化合物包括乙酸、異丁酸和4-羥基丁酸。其中，乙酸是生成乙酸酯類物質的重要前體物質。通常酸類物質的氣味閾值較高，加之其在發酵醉鱘魚制品中的含量較低，使得其對發酵醉鱘魚香氣的貢獻較小。

酮類屬于羰基化合物，也是脂肪氧化得到的產物。酮類物質共鑒定出2種，種類較醛類少，但由于較低的氣味閾值，也是風味構成的重要因素。

其他類化合物，包括2種烷烴類化合物(十一烷、1,1,3-三乙氧基丙烷)，2種烯烴類化合物(檸檬烯、茴香腦)，1種酸酐類化合物(乙酸酐)，2種芳香烴(萘、均三甲苯)，1種呋喃(2-戊基呋喃)和3種含氮化合物(2,5-二甲基吡嗪、吲哚和2-乙?；量?。有報道稱C8～C19烷烴的氣味閾值較高，對整體風味沒有實際貢獻作用[29]。檸檬烯和茴香腦一般來自于香辛料，也有可能是通過飼料在魚體內進行富集[30]。2-戊基呋喃具有泥土、清香、果香、豆香以及類似蔬菜的香氣，是n-6脂肪酸如亞油酸的一種氧化產物[31]，在臘肉制品和發酵香腸[32-33]中都有檢測到。并且它的氣味閾值相對較低，對總體風味具有重要的貢獻。還原糖和氨基酸之間發生美拉德反應可以產生含氮類化合物如吡嗪類和吡啶類，同時氨基酸的熱降解反應可以產生腈類等含氮物質。通常含氮雜環類化合物在肉中的含量較低，但這類物質卻有著極低的氣味閾值，對肉制品的風味具有較高的貢獻度。甲基吡嗪是美拉德反應的產物，具有堅果香味，在烘烤加工的肉類制品中，經常可以檢測到吡嗪類物質[33]。

表3 發酵醉鱘魚的揮發性風味物質Table 3 Volatile flavor of fermented and wine-aroma sturgeon

為了確定影響發酵醉鱘魚風味的主要活性物質，參照各風味物質的氣味閾值，計算揮發性物質的相對氣味活度值，如表4所示，其中OAV>1的揮發性物質屬于氣體活性物質，分別為3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇、糠醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯、3-甲基丁醛、壬醛、苯甲醛、2-戊基呋喃、萘和茴香腦。為了更加直觀地評估各揮發性風味成分對樣品整體風味的貢獻程度，對上述13種OAV > 1揮發性成分的ROC進行了計算，結果見表5。3-甲基丁醛的ROC為35.12%，乙酸乙酯的ROC為23.03%，壬醛的ROC為13.49%，苯甲醛的ROC為9.75%，1-辛烯-3-醇的ROC為6.43%，3-甲基-1-丁醇的ROC為4.36%，乙酸異戊酯的ROC為3.87%，2-戊基呋喃的ROC為2.91%，這些物質對氣味的貢獻率較大，是形成濃郁酵母發酵風味的關鍵成分。

2.3 發酵條件對發酵醉鱘魚關鍵風味物質的影響

2.3.1 酵母菌添加量對發酵醉鱘魚關鍵風味物質的影響

酵母菌添加量對發酵醉鱘魚的8種關鍵風味化合物含量的影響如圖1所示，從8種關鍵物質的總含量來看，隨著酵母菌添加量增加，關鍵化合物總含量出現先增加后降低的趨勢，并且在酵母菌添加量為0.8%時，含量最大。從圖1可以看出，隨著酵母菌添加量的增加，乙酸乙酯、1-辛烯-3-醇、壬醛和苯甲醛的含量出現增加后減少的趨勢，當酵母菌添加量為0.8%時，含量達到最高；3-甲基丁醛和2-戊基呋喃在酵母菌添加量為0.8%和1.2%時具有較高含量，其中3-甲基丁醛作為微生物降解亮氨酸得到的產物，其對于發酵風味的形成具有重要的影響[13]；而3-甲基-1-丁醇的含量在酵母菌添加量為0.4%～1.2%時變化趨勢不明顯，處于平穩狀態，但酵母菌添加量為1.6%時的含量顯著低于其余添加量。分析原因主要是由于適宜的添加量使得酵母在短時內生長較好，獲得較多的揮發性風味物質；但是過高的酵母菌添加量使得菌液濃度過大，生長空間及養分有限，反而影響了酵母菌對魚塊的發酵增香的效果。綜合上述分析，認為酵母菌添加量為0.8%的質量分數時，發酵醉鱘魚的5種關鍵風味物質(乙酸乙酯、1-辛烯-3-醇、3-甲基丁醛、壬醛和苯甲醛)含量最高，發酵風味濃郁。

表4 發酵醉鱘魚活性風味物質及其OAV值Table 4 Odor activity values of aroma-active compounds in fermented and wine-aroma sturgeon

注：a:水中檢測值；b:啤酒中檢測值。

表5 發酵醉鱘魚活性風味物質及其ROC值Table 5 Relative odor contribution values of aroma-active compounds in fermented and wine-aroma sturgeon

圖1 酵母菌添加量對8種關鍵風味化合物含量的影響Fig.1 Effect of yeast addition on the content of eight volatile compounds

2.3.2 發酵溫度對發酵醉鱘魚關鍵風味物質的影響

發酵溫度作為影響發酵醉鱘魚加工的一個重要條件，對于發酵醉鱘魚整體品質有重要的作用。合適的發酵溫度，微生物的代謝比較旺盛，可以加速發酵，縮短發酵時間。從圖2中8種關鍵風味物質的總含量進行分析，可以看出8種關鍵風味物質的總含量變化總體呈現先升高再下降的趨勢，28 ℃的發酵溫度含量最高。同時從圖2可以看出，隨著發酵溫度的逐漸升高，3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯和3-甲基丁醛的含量出現了先增加后減少的趨勢，并且在發酵溫度為28 ℃時，含量達到最高。發酵溫度上升前期(25 ℃～30 ℃)，1-辛烯-3-醇、乙酸異戊酯的含量變化不大，但當發酵溫度升高至35 ℃時，它們的含量顯著下降，達到最低，且壬醛和2-戊基呋喃的含量隨著溫度的升高也出現了下降的趨勢，說明溫度過高不利于風味物質的形成。另外，從4種不同發酵溫度的發酵醉鱘魚所占8種關鍵風味物質的種類來看，28 ℃和30 ℃發酵組包含所有8種關鍵風味化合物。25 ℃、28 ℃的風味物質含量逐漸增加，說明在一定溫度范圍內，較高的溫度有利于酵母菌生長代謝。但是當發酵溫度為35 ℃時，過高的溫度抑制了酵母菌的生長，使得適宜35 ℃下生長的大量微生物繁殖，影響了酵母菌發酵增香的效果。綜合以上分析，認為發酵溫度為28 ℃時，發酵醉鱘魚的5種關鍵風味物質(3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇和乙酸異戊酯)含量最高，發酵風味濃郁。

圖2 發酵溫度對8種關鍵風味化合物含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperatures on the content of eight volatile compounds

2.3.3 發酵時間對發酵醉鱘魚關鍵風味物質的影響

發酵時間對發酵醉鱘魚的8種關鍵揮發性風味化合物含量的影響如圖3所示，通過8種關鍵物質的總含量進行分析，6 h組的關鍵物質總含量達到最高，但與8 h組的總含量相差不大。3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、苯甲醛和2-戊基呋喃隨著發酵時間的增加都出現先增加后減少的趨勢，其中，3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醛和2-戊基呋喃在發酵時間為6 h時含量最高，1-辛烯-3-醇在發酵時間為10 h時含量最高，壬醛和苯甲醛在發酵時間為8 h時含量最高。發酵時間的延長，可以讓微生物充分利用碳水化合物、蛋白質和脂肪進行降解，產生的關鍵風味物質的含量也會更多，但同時發酵過度也可能帶來酒精度、酸度過高，從而導致口感變澀、變差。綜合以上分析，認為發酵時間為6 h時，發酵醉鱘魚的4種關鍵風味物質(3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醛和2-戊基呋喃)含量最高，發酵風味最為濃郁。

圖3 發酵時間對8種關鍵風味化合物含量的影響Fig.3 Effects of fermentation time on the content of eight volatile compounds

3 結論

通過GC-MS技術分析鑒定了發酵醉鱘魚的關鍵風味物質為3-甲基丁醛、乙酸乙酯、壬醛、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸異戊酯和2-戊基呋喃，風味貢獻率分別為35.12%、23.03%、13.49%、9.75%、6.43%、4.36%、3.87%和2.91%；隨著酵母菌添加量、發酵溫度以及發酵時間的增加，關鍵化合物含量均出現先增加后降低的趨勢，其中發酵溫度、發酵時間相比接種量，對關鍵風味物質影響更大：溫度過高或過低都不利于酵母菌的生長，導致25℃和35℃組的關鍵風味物質(3-甲基-1-丁醇、壬醛及2-戊基呋喃等)的含量顯著低于其余2個發酵組；發酵時間過短，風味物質形成不足，導致4 h組的關鍵風味物質含量顯著低于其余發酵組；而發酵時間過長亦不利于醉鱘魚濃郁發酵風味的形成，導致10 h和12 h組的關鍵風味物質(乙酸異戊酯、壬醛、苯甲醛)的含量顯著低于6 h和8 h組。然而，這些關鍵風味物質在復雜食品體系內對醉鱘魚風味品質的貢獻是否與儀器檢測計算的相吻合，還需要風味缺失實驗和風味重構實驗加以證實。