釀酒葡萄DNA的提取方法

王舸楠，馬文瑞，全莉，王雪微，武運*，薛潔

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊，830052) 2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)

DNA不僅是生物個體的遺傳物質，而且還是其遺傳信息的運載體。獲取高質量的DNA是進行PCR擴增、電泳檢測、遺傳多樣性分析以及基因圖譜構建等下游分子生物學研究試驗的基礎[1]。植物的基因組DNA提取首先裂解細胞壁、細胞膜，除去多糖和多酚等次生物質；然后使用酚和氯仿變性分離蛋白質；最后富集核酸、去除RNA和濃縮DNA等幾個步驟。且DNA的提取效率尤其是純度會嚴重影響到實驗的結果，對于同種植物采用不同方法或者不同植物采用相同的方法其純度和提取率都有所不同[2]。對于葡萄而言，其多糖、多酚、單寧等大分子物質含量較高，這些物質易與核酸結合形成復合物。多酚類物質能使DNA氧化成棕褐色凝膠狀物，多糖類物質能與DNA結合成黏稠的膠狀物，這些膠狀物溶解度較低，嚴重影響DNA的濃度和純度[3-4]。因此需要根據葡萄特性，找到適合葡萄DNA的提取方法，從而提高DNA的質量。

本研究選取新疆天山北麓葡萄酒產區4個優良紅白釀酒葡萄品種為試材，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB)和商業試劑盒法提取釀酒葡萄基因組DNA，通過比較，得出最適合提取釀酒葡萄DNA的方法。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的片段大小及質量，同時在核酸蛋白儀上測定樣品DNA的濃度，最后通過PCR擴增驗證DNA質量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取新疆天山北麓葡萄酒產區的4個優良釀酒葡萄品種果實，具體見表1，置于-80 ℃冰箱貯藏備用。

表1 四個釀酒葡萄品種及其分子身份證編碼Table 1 Four wine grape varieties and their molecular ID

1.2 儀器與設備

BG-sub MIDI多用途水平電泳儀、BG-Power600 通用電泳儀電源，北京百晶生物技術有限公司；Tanon 1600凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；BioSpec-nano核酸蛋白檢測儀、微量移液器,德國Eppendorf公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 提取試劑

0.5 mol/L EDTA-Na2溶液(pH值為8.0)，1 mol/L Tris-HCl溶液(pH值為8.0)，預提取緩沖液，1×TE緩沖液(pH值為8.0)，Tirs飽和酚/氯仿(1∶1，體積比)，氯仿/異戊醇溶液(24∶1，體積比)。

1.3.2 釀酒葡萄品種基因組DNA提取方法

將新鮮釀酒葡萄放置-80 ℃冷凍，待果實凍硬后去梗，使用潔凈刀片切塊，然后放入冷凍干燥儀中1～2 d，至果實完全凍干后，最后使用液氮迅速研磨成粉，同時，放入-20 ℃保藏備用。分別采用改良的CTAB法和2種商業試劑盒提取基因組DNA。每個試驗重復3次。

1.3.2.1 改良的CTAB法

(1)將配制好的質量分數為2%CTAB裂解緩沖液，放入60 ℃水浴鍋中，恒溫水浴15 min；

(2)稱取適量研磨好的樣品放入5 mL離心管中，加入600 μL預提取緩沖液，冰上研磨成勻漿；

(3)加入1 200 μL預熱的2%CTAB裂解緩沖液，同時，加入β-巰基乙醇，使其最終濃度達到20 μL/mL，混勻；

(4)60 ℃恒溫水浴90 min，期間每隔10 min輕微振蕩離心管；

(5)恒溫水浴結束后立即放入冰盒，冷卻至室溫。加入與步驟(2)等體積Tirs飽和酚/氯仿=1∶1，振蕩混勻，放置室溫靜置，待溶液中出現白色絮狀沉淀時，12 000 r/min離心 15 min，最大程度移取上清液；

(6)加入2/3倍體積的氯仿/異戊醇=24∶1，振蕩混勻，放置室溫靜置，待溶液中出現白色絮狀沉淀時，12 000 r/min離心 10 min，最大程度移取上清液；

(7)加入 4～7 μL RNase A，輕微振蕩混勻，37 ℃恒溫水浴30 min；

(8) 恒溫水浴結束后立即放入冰盒，冷卻至室溫。加入步驟(7)所獲體積的0.8/10倍5 mol/L NaCl與2/3倍的異丙醇，混勻，-20 ℃靜置 30 min；

(9)12 000 r/min離心 15 min，棄上清液；

(10)加入600 μL 70 %乙醇，使之與沉淀充分接觸后，8 000 r/min，離心 2 min，棄上清液，這一步驟重復2遍；

(11)將離心管放置室溫，待沉淀干燥后，加入80 μL 1×TE緩沖液(pH值為8.0)，混勻，-20 ℃保存備用。

1.3.2.2 試劑盒法

選用的試劑盒分別是QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit(50)試劑盒和天根生化科技(北京)有限公司高效植物基因組試劑盒進行植物基因組DNA提取，操作步驟嚴格按照使用手冊進行。本試驗中使用2個公司的試劑盒用A和B表示，順序與文中出現的順序沒有對應關系。

1.3.3 DNA質量檢測

1.3.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測

使用質量分數為0.8%瓊脂糖凝膠對3種不同方法提取得到的樣品進行電泳檢測，5 μL DNA樣品與1 μL 6×loading buffer混勻后進樣，80 V，30 min，恒壓對DNA樣品進行電泳，并在凝膠成像系統下觀察，并照相分析。

1.3.3.2 核酸蛋白檢測儀檢測

使用BioSpec-nano核酸蛋白檢測儀對3種不同方法提取得到的樣品，進行濃度和純度檢測，通過對DNA濃度、 OD260/OD280和OD260/OD2303個方面進行結果分析，比較3種提取方法的優缺點，最終確定最優的釀酒葡萄基因組DNA提取的方法。

1.3.3.3 PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測

根據1.3.3.1和1.3.3.2的試驗結果比對，選擇濃度和純度結果均較高的DNA樣品，進行PCR擴增檢測。選用植物內源基因18S rDNA基因，對釀酒葡萄基因組DNA進行PCR擴增。上游引物(F)：5′-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3′；下游引物(R)：5′-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3′[5]。

本試驗采用25 μL反應體系進行PCR擴增，參照10×PCR Buffer說明書，建立25 μL反應體系為：15 mmol/L Mg2+2.50 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.00 μL，5.0 U/μLTaq酶 0.20 μL，10 μmol/L引物1.00 μL，DNA模板1.00 μL，剩余用超純水補足。

PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環，最后72 ℃延伸7 min。

PCR擴增產物使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，110 V，20 min，恒壓對PCR擴增產物進行電泳，并在凝膠成像系統下觀察，并照相分析。

2 結果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果與分析

通過3種不同方法提取釀酒葡萄基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，不同方法均有條帶，但是差異較大。通過比較3種方法的電泳圖譜，可以得出，圖1條帶清晰，無拖尾現象，說明改良的CTAB法提取DNA完整性較好。圖2條帶較清晰，有拖尾現象，并且進樣口處有光斑，說明存在蛋白和其他大分子雜質污染現象。圖3條帶模糊，有拖尾現象，說明DNA純度不高，并且存在雜質污染。3種方法提取的DNA濃度需要使用核酸蛋白檢測儀進行檢測。

M-D 15000 DNA marker；1-赤霞珠；2-霞多麗； 3-美樂；4-玫瑰香圖1 釀酒葡萄基因組DNA的CTAB法瓊脂糖 凝膠電泳結果Fig.1 CTAB agarose gel electrophoresis of genomic DNA from wine grape

M-D 15000 DNA marker；1-赤霞珠；2-霞多麗； 3-美樂；4-玫瑰香圖2 釀酒葡萄基因組DNA的A試劑盒瓊脂糖凝膠 電泳結果Fig.2 Kit A agarose gel electrophoresis of genomic DNA from wine grape

M-D 15000 DNA marker；1-赤霞珠；2-霞多麗； 3-美樂；4-玫瑰香圖3 釀酒葡萄基因組DNA的B試劑盒瓊脂糖凝膠 電泳結果Fig.3 Kit B agarose gel electrophoresis of genomic DNA from wine grape

2.2 核酸蛋白檢測儀檢測結果與分析

對釀酒葡萄基因組DNA的提取，選用3種不同提取方法均可獲得DNA，但不同方法所獲得的DNA質量差異較大，具體結果見表2。當OD260/OD280在1.8～2.0之間，說明DNA相對完整，濃度較高。當OD260/OD280<1.8時，提取的基因組DNA樣品中可能存在蛋白質污染；當OD260/OD280>2.0時，提取的基因組DNA中含有一定量的RNA；當OD260/OD230<2.0時，基因組DNA樣品中可能在提取過程中有殘存的鹽等含量較少的雜質。改良的CTAB法提取的基因組DNA樣品的OD260/OD280比值均在1.8左右，說明所有樣品的總DNA含量較高，相對完整。使用A試劑盒提取的DNA樣品的OD260/OD280比值<1.8，說明DNA樣品中存在蛋白等雜質污染，與圖2的結果分析相一致。使用B試劑盒提取的DNA樣品的OD260/OD230<2.0，說明DNA樣品中含有少量小分子雜質污染，與圖3的結果分析相一致。

表2 不同方法提取的釀酒葡萄基因組DNA的 質量檢測結果Table 2 Quality result of different wine-grape DNA extracted by diferent methods

注：1-赤霞珠；2-霞多麗；3-美樂；4-玫瑰香。

2.3 PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測結果與分析

選用改良的CTAB法提取的基因組DNA進行PCR擴增植物內源基因18S rDNA基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖4。所有樣品均能擴增出PCR條帶，條帶清晰，無拖尾現象。說明改良的CTAB法提取的釀酒葡萄基因組DNA濃度和純度均較高，可以進行PCR擴增、電泳檢測、遺傳多樣性分析以及基因圖譜構建等下游分子生物學研究試驗。

M-D 2000 DNA marker；1-赤霞珠；2-霞多麗； 3-美樂；4-玫瑰香圖4 PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.4 Results of PCR amplification and agarose gel electrophoresis

3 討論

不同植物因個體差異，植物內部組織含有的物質種類和含量差異較大，對于最適的基因組DNA的提取條件也有所不同。目前，基因組DNA的提取方法基本成熟，常用的提取植物基因組DNA方法有CTAB法、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)法、離心柱法、磁珠法和商業DNA提取試劑盒[6]。提取過程包括破碎細胞壁、裂解細胞膜、去除多糖，多酚等次生物質、變性分離蛋白質、沉淀核酸、去除RNA和濃縮DNA等幾個步驟[7]。針對釀酒葡萄富含多糖、多酚、色素和細胞壁較厚等問題，尋求最適的提取方法，對后續生物學檢測非常重要。因此，本研究選用改良的CTAB法和2種不同的商業試劑盒進行提取方法比對，最終得出1種適合釀酒葡萄品種基因組DNA的提取方法。

葡萄中的多糖，多酚等物質容易與DNA形成復合物，較難溶解。因此根據葡萄特性改進傳統CTAB的提取條件，從而獲得高質量的葡萄基因組DNA是后續分子生物學研究的基礎[8]。目前，改良的傳統提取方法受到國內外許多研究者的認可。首先，葡萄果實汁多肉少，富含多糖等次生代謝產物，針對這一特點，本研究將果實進行冷凍干燥，不僅能去除組織中大量的水分，還能去除一部分糖物質。段婧婧[9]等以木瓜為試驗材料，對傳統CTAB法進行改良，最終確定先將試材前處理冷凍干燥后液氮研磨成粉，確定了最適的材料粉末添加量和PVP添加量，能有效提高木瓜基因組DNA濃度。本研究使用預提取緩沖液進行組織破碎，最大程度保護DNA完整性。裂解緩沖液中添加了30 g/L PVP-40和20 μL/mL β-巰基乙醇，最大程度阻止了多酚物質氧化，降低了多酚氧化物與DNA形成復合物的幾率，從而提高葡萄DNA的純度，保證了PCR擴增的產量。劉鍇棟等[10]采用傳統CTAB法和改良CTAB法，分別對野生荔枝的總DNA進行提取，結果表明改良的方法提取的DNA比傳統方法提取的DNA質量和純度都要高。本研究在蛋白變性去除后，添加RNase A，37 ℃恒溫水浴30 min，有效分解了溶液中的RNA，然后添加異丙醇，醇類物質與DNA分子團中的水分子結合，DNA因失水而發生聚合，低溫沉降DNA，從而提高DNA的濃度。高媛等[11]以蘋果種子和果肉為試材，采用改良CTAB法、SDS法與高鹽低pH SDS法進行基因組DNA的提取，結果顯示，CTAB提取液中加入質量分數為1% 的PVP和質量分數為1% 的β-巰基乙醇，能夠有效降低酚化合物的離子化并且防止酚類物質的氧化，得到的DNA產量最高。徐美隆等[12]以葡萄嫩葉為研究材料，選用改良CTAB法和試劑盒法分別提取DNA，結果顯示，改良CTAB法提取的總DNA進行PCR擴增驗證，電泳條帶清晰明亮，說明總DNA質量較高。齊玲倩等[13]以水果果肉為試材，采用改良CTAB法、商業試劑盒和行業標準法3種方法對提取效果進行對比，結果說明，改良CTAB法提取的水果果肉DNA濃度和純度均比其他2種方法高。

綜上所述，針對葡萄果實特性對其基因組DNA提取方法進行了改良，在前處理過程中進行真空冷凍干燥以去除葡萄中可溶性多糖與水分，并加入600 μL預提取緩沖液以去除多糖，防止多酚氧化，并洗滌DNA，提高DNA提取效率；在提取過程中加入1 200 μL裂解緩沖液，可進一步增大DNA提取效率；為聚合DNA而加入異丙醇，時間越長可使DNA聚合效率增高，從而增加DNA的濃度。本文使用3種提取方法提取葡萄中的DNA并對比瓊脂糖凝膠電泳基因組DNA條帶，檢測基因組DNA的質量并通過PCR擴增驗證，最終確定改良的CTAB法提取的葡萄基因DNA樣品質量最高，能夠滿足后續的研究要求。